مطالب علمیمطالب علمیمیکروبیولوژی

روش دیسک دیفیوژن در آنتی بیوگرام

آنتی بیوگرام

روش دیسک دیفیوژن

 

این روش برای نخستین بار توسط دانشمندانی به نام های Bauer و Kirby  ارائه شد و به همین جهت نام دیگر روش انتشار دیسک، روش Kirby-Bauer  است. در این روش از دیسک های کاغذی آغشته به آنتی بیوتیک استفاده می شود.

روش انجام کار

بعد از ایزوله کردن باکتری ، به دلیل اینکه به کار بردن تعداد کم و یا زیاد باکتری منجر به یافته های اشتباه خواهد شد، استفاده از تعداد مناسب باکتری مورد آزمایش بسیار مهم است. بنابراین باید پس از آماده سازی سوسپانسیون باکتری از روش کدورت سنجی استفاده کرده و تعداد تقریبی باکتری را در آن محلول مشخص نمود. این مرحله را در اصطلاح استاندارد نمودن تعداد باکتری می گویند.برای این منظورابتدا از کلنی ­های موجود در محیط بلاد آگار، کشت ۲۴ ساعته تهیه میکنیم.سپس مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم . باید درانتخاب مقدار نمونه دقت کنیم تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداریم . اگر میزان کدورت کمتر از نیم مک فارلند باشد ، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم و یا اگر میزان کدر بودن ، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند برسیم . بعد از تهیه محلول هموژن خود ،سواپ استریل را به لوله آغشته کرده و به جداره ­های داخلی لوله کاملا تماس داده تا اضافی سوسپانسیون گرفته شود و سپس بر روی محیط مولرهینتون آگار در تمام جهات کشت داده تا در سطح پلیت کاملا تلقیح گردند.


مقایسه کدورت لوله حاوی سوسپانسیون باکتری با لوله نیم مک فارلند

 

پلیت­ ها را به مدت ۱۰-­۵ دقیقه در دمای اتاق گذاشته تا رطوبت آنها جذب شود، سپس دیسک­ های آنتی بیوتیکی  مورد استفاده را که از فریزر ۲۰- درجه سانتی­گراد از قبل خارج شده اند تا به دمای محیط برسند، با کمک پنس استریل در کنار شعله و زیر هود میکروبیولوژی با استفاده از پنس استریل با فاصله ۲۰ میلی­­متر از لبه پلیت و ۲۵ میلی­ متر از یکدیگر در سطح پلیت قرار داده می شوند.

در انتها پلیت­ها را به صورت واژگون جهت جلوگیری از تعریق سطح پلیت به انکوباتور ۳۵ درجه سانتی­گراد انتقال داده و نتایج پس از  ۱۸ ساعت مورد بررسی قرار می گیرند.

تفسیر نتایج

پیش از خواندن نتیجه باید پلیت را از نظر رشد مناسب، هم گون و خالص بودن گونه باکتری بررسی کرد (کلنی ها باید یک شکل باشند.) اگر هاله عدم رشد نامشخص و درهم باشد تکرار آزمایش لازم است. در صورت خالصبودن کشت و نیز مشخص بودن هاله عدم رشد باید مراحل اندازه گیری آن انجام گیرد. در مرحله اندازه گیری بدون باز کردن در پلیت و تنها از پشت پلیت وبا  استفاده از خط کش یا کولیس قطر هاله عدم رشد اندازه گیری و بر اساس میلی متر ثبت می شود. به منظور تفسیر این نتایج از جداول استانداردی که توسط CLSI ارائه شده است، استفاده می گردد. با استفاده از این جداول و اندازه قطر هاله عدم رشد هر داروی ضد میکروبی، باکتری دریکی از دسته های مقاوم، نیمه حساس و حساس قرار می گیرد.

 

 چند نکته مهم در تفسیر نتایج 

  • در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده کنید .
  • همیشه امتداد خط کش باید از وسط دیسک عبور کند .
  • همیشه قطر اندازه گیری می شود .
  • باید در تست انتی بیوگرام ، نگاه بدبینانه ای داشت . یعنی اینکه کوتاهترین مسیر را برای تعیین حساسیت انتخاب می کنیم .
  • اگر در اطراف دیسک خط هایی کشیده شده باشد در این صورت باید از آخرین خطی که بعد از آن دیگر کلونی نیست تعیین حساسیت کرد.
  • اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم باشد باید از همان جا تا دیسک را اندازه گیری کرد نه کل هاله را .
  • همیشه به محل هاله دقت کنید بازم می گم همیشه و کوتاهترین مسیررا انتخاب کنید .
  • دیسک ها و هاله ها را در زیر نور برسی کنید .
محیط کشت در آنتی بیوگرام

محیط مورد استفاده در روش دیسکی مولرهینتون است که باید pH آن بین ۴/۷-۲/۷ تنظیم شده باشد .

و در پلیت به قطر ۱۰۰ میلی متر حدود ۳۰-۲۵ میلی لیتر محیط مولر هینتون میریزیم و قطر مورد نظر حاصل می‌گردد. جهت اجتناب از خشک شدن سطح محیط باید پلیتها را در کیسه‌های پلاستیکی نگهداری نمود.پس از تلقیح محیط آنتی بیوگرام در فاصله حداکثر ۱۵ دقیقه می‌باید دیسکهای آنتی بیوتیک را در سطح آگار با فاصله مناسب از یکدیگر قرار داد.سپس به مدت ۱۸-۱۶ ساعت در انکوباتور ۳۵ درجه سانتی‌گرام نگهداری نمود. روشهای اصلاح شده در باکتریهای سخت رشد نیز یکی دیگر از روش ها است در بعضی از باکتریهای سخت رشد از محیط های کشت اختصاصی استفاده می شود مانند : محیط کشت HTM در هموفیلوس ها .

نکات بسیار مهم در آنتی بیوگرام
  • تست همیشه در زیر هود و در کنار شعله انجام شود .
  • باکتری ایزوله شده باید ، خالص رشد کرده باشد .
  • در زمان برداشت نمونه باید سعی شود که از یک کلونی برداشت شود .
  • قبل از انتقال سواب به محیط کشت مولر هینتون ، محیط کشت را از عدم رشد کلونی های باکتری در محیط کشت مولر هینتون برسی کنیم . اگر کلونی در محیط کشت دیده شد ، محیط را عوض می کنیم .
  • همیشه به وسیله انس نموه را برداشته و سپس به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل اضافه کنید .
  • برای اینکه به کدروت مورد نظر نیم مک فارلند دست یابید ، از مقادیر کم کلنی شروع کنید و یا کلونی را ابتدا به دیواره لوله انتقال دهید و سپس کم کم کلونی را به محیط آبگوشت اضافه کنید تا به کدورت مورد نظر دست یابید .
  • همیشه بعد از باز کردن در لوله و بعد از بستن آن ، سر لوله را در معرض شعله قرار دهید .
  • اگر پنبه سر لوله ها ، به سطح هود افتاد باید آنها را دور انداخت .
  • اگر سوآب را به خوبی آب گیری نکنیم در این صورت به علت تبخیر مایع بالایی در انکوباسیون ممکن است رطوبت در سر طرف مولر هینتون قرار گیرید .
  • همیشه بعد از اینکه محیط کشت را با سواب کشت چمنی دادیم ، سواب را به ظرف حاوی مواد ضد عفونی یا استریل کننده انتقال دهیم .
  • اگر نمونه مورد نظر ما مشکوک به سودوموناس است (بوی شبیه گل یاس) در این صورت سواب را ابتدا در روی شعله قرار دهید و سپس به محیط ضد عفونی کننده انتقال دهید .
  • هیچ وقت سواب را به دور محیط کشت حرکت ندهید .
  • همیشه قبل از باز کردن محیط کشت ، سر پلیت را با شعله ضد عفونی کنید .
  • برای راحتی کار ، ابتدا دیسک ها را بر روی پلیت تعیین مکان کنید و سپس به محیط اضافه کنید .
  • تا زمانی که دیسک ها را در روی محیط مولر هینتون ، فشار نداده اید می توانید جای آنها را تغییر دهید . اما بعد از فشار هیچ وقت نباید آنها را تغییر داد .
  • همیشه دیسک ها را از بالا توسط یک گیره به محیط اضافه کنید .
  • فبل از گذاشتن دیسک سعی شود که هر دو طرف را برسی کنید تا اگر دیسک حاوی نام نباشد ، از به کار گیری آن خودداری کنید .
خطا های تست انتی بیوگرام
  • اگر بیشتر از یک کلونی برداشت شود ، نتیجه تست ما کلا اشتباه خواهد بود . چون در این صورت با تست آنتی بیوگرام ، چند کلونی را از نظر حساسیت برسی کردیم که ممکن است یک کلنی حساس باشد و دیگری نه . پس دقت شود .
  • اگر محیط کشت ما بعد از انکوبه ، به صورت خط خطی باشد نشان دهنده این است که مقدار کلونی ماکمتر از نیم مک فارلند بود .
  • اگر در دور تمام دیسک ها هاله تشکیل شد و یا در اطراف هیچ یک از دیسک ها هاله ای تشکیل نشد برای برسی نتایج باید تست را تجدید کرد .
  • اگر PH محیط مولر هینتون مناسب نباشد نتایج ما اشتباه خواهد بود .
  • نگه داری غلط دیسک ها و استفاده از محیط های تاریخ گذشته موجب خطا می شود .
  • تهیه اشتباه محیط نیم مک فارلند هم میتواند باعث اشتباه شود .
  • تأخیر زیاد بین استاندارد کردن کدورت کشت و تلقیح پلیت
  • همراه بودن سواب با مقدار زیادی مایع آبگوشت به هنگام تلقیح محیط آنتی بیوگرام (نگرفتن مایع اضافی با جدار لوله)
نمایش بیشتر

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دو × سه =

دکمه بازگشت به بالا
بستن