مولکولی

ساخت یا سنتز cDNA از  RNA استخراج شده از سلول و بافت

cDNA

 

سنتز cDNA

برای بررسی دقیق بیان ژن‌ها به تعیین مقدار mRNA نیاز است. از طرفی اساس PCR تکثیر DNA به عنوان الگوی اسیدنوکلئیک است نه RNA، به همین منظور در ابتدا باید از روی RNA به روش نسخه‌برداری معکوس DNA سنتز شود. به DNA سنتز شده به این روش cDNA یا Complementry DNA گفته می‌شود.

اساس سنتز cDNA مبتنی بر عملکرد آنزیم نسخه‌بردار معکوس است که قابلیت سنتز DNA را از RNA تک رشته دارد. چندین نوع از این آنزیم وجود دارد: HIV-1, AMV,MMLV و آنزیم نسخه‌بردار معکوس تلومرازی.

سنتز cDNA را می‌توان بر روی RNA تام و یا mRNA خالص شده انجام داد. مواد مورد نیاز در این واکنش بافر، dNTP، آب فاقد RNase، آنزیم ریورس ترانس کریپتاز و RNA است.

سه نوع پرایمر در روند ساخت cDNA قابل استفاده است:

  1. پرایمر اختصاصی برای ژن مورد نظر
  2.  رندوم هگزامر که قابلیت تکثیر انواع RNA را دارد.
  3. الیگو dt ، که به طور اختصاصی به دم پلی ا در انتهای mRNA متصل شده و آن را تکثیر می‌کند.

تکثیر cDNA در محدوده‌ی دمای۳۷ تا ۵۰ درجه سانتیگراد بطور خاص برای هر کیت قابل انجام است. در انتها واکنش برای غیر فعالسازی آنزیم آن را در محدوده دمای بین ۷۵ تا ۹۵ درجه سانتیگراد قرار می‌دهند.

برچسب ها
نمایش بیشتر
دکمه بازگشت به بالا
بستن