استخراج RNA
استخراج RNA به منظور تخلیص RNA از نمونه‌های سلول و بافت انجام میشود. این روش به واسطه‌ی حضور آنزیم‌های ریبونوکلئاز بسیار سخت و پیچیده است، به همین منظور توصیه میشود قبل از شروع کار همه‌ی وسایل با محلول‌های خنثی کننده‌ی RNase ,DEPC شستشو داده شده و تمامی مراحل با دستکش زیر هود انجام شود.
چندین روش برای استخراج RNA وجود دارد که در زیر به بخشی از آن اشاره می شود.
روش فنل-کلروفرم ۱
چندین روش برای استخراج RNA وجود دارد که مهمترین آن فنل _ کلروفرم است.
این روش، استخراج مایع-مایع بوده که برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک، حذف پروتئین‌ها و لیپیدها کاربرد دارد.
روش فنل-کلروفرم ۲
در این روش بافت‌های هموژن، سلول‌های لیز شده و نمونه‌های محلول با حجم مساوی از فنل و کلروفرم ترکیب شده، پس از سانتریفوژ دو فاز مجزای آبی و آلی شکل می‌گیرد. پروتئین و لیپیدهای هیدروفوب در فاز آلی پایینی قرار می‌گیرند و در فاز آبی (بالایی) اسیدهای نوکلئیک و سایر آلاینده‌ها مانند نمک، قند و… قرار دارند. هنگام پیپت کردن و جداسازی فاز آبی باید نهایت دقت صورت گیرد تا از فاز آلی، خصوصا قسمت فوقانی آن که حاوی پروتئین است وارد فاز آبی نشود.
روش فنل-کلروفرم ۳
مقدار PH محلول برای خالص سازی RNA از DNA تعیین کننده است.
در شرایط اسیدی DNA به فاز آلی انتقال می‌یابد و RNA در فاز آبی می‌ماند، در شرایط بازی هر دو در فاز آبی باقی خواهند ماند.
روش فنل-کلروفرم ۴
با استفاده از ایزوپروپانول، RNA رسوب داده میشود و در مرحله‌ی آخر با اتانول ۷۰%-۸۰% شستشو و خالص‌سازی صورت می‌گیرد.
در نهایت رسوب حاصل از RNA در حجم معینی از آب فاقد RNase حل میشود.
نقش کلروفرم در استخراج RNA
فنل به تنهایی می‌تواند ۱۰ تا ۱۵ درصد آب را حفظ کند و به دنبال آن RNA کاهش می‌یابد، اضافه کردن کلروفرم باعث اتصال متراکم آن با فنل شده و منجر به رهاسازی آب میشود. ترکیب کلروفرم با فنل روند تخریب پروتئین‌ها را شدت می‌بخشد و لیپید را حل می‌کند.
