روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت

برای مشاهده ی آموزش ویدئویی استخراج RNA اینجا کلیک کنید یا به انتهای مطلب مراجعه کنید.

در این بخش از مطالب علمی به سراغ مبحث بسیار مهم استخراج RNA  می رویم با ما همراه باشد.

به منظور تخلیص RNA از نمونه‌های سلول و بافت ، استخراج RNA انجام می‌‌شود. این روش به واسطه‌ی حضور آنزیم‌های ریبونوکلئاز بسیار حساس و پیچیده است، به همین منظور توصیه می‌شود قبل از شروع کار همه‌ی وسایل با محلول‌های خنثی کننده‌ی RNase مانند محلول DEPC شستشو داده شده و تمامی مراحل با دستکش زیر هود انجام شود.

چندین روش برای استخراج RNA وجود دارد که در زیر به بخشی از آن اشاره می شود.

روش فنل-کلروفرم ۱

مهمترین روش استخراج RNA فنل _ کلروفرم است.
این روش، استخراج مایع-مایع بوده که برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک، حذف پروتئین‌ها و لیپیدها کاربرد دارد.

روش فنل-کلروفرم ۲

در این روش بافت‌های هموژن، سلول‌های لیز شده و نمونه‌های محلول با حجم مساوی از فنل و کلروفرم ترکیب شده، پس از سانتریفوژ دو فاز مجزای آبی و آلی شکل می‌گیرد. پروتئین و لیپیدهای هیدروفوب در فاز آلی پایینی قرار می‌گیرند و در فاز آبی (بالایی) اسیدهای نوکلئیک و سایر آلاینده‌ها مانند نمک، قند و… قرار دارند. هنگام پیپت کردن و جداسازی فاز آبی باید نهایت دقت صورت گیرد تا از فاز آلی‌، خصوصا قسمت فوقانی آن که حاوی پروتئین است وارد فاز آبی نشود.

روش فنل-کلروفرم ۳

مقدار PH محلول برای خالص سازی RNA از DNA تعیین کننده است.
در شرایط اسیدی DNA به فاز آلی انتقال می‌یابد و RNA در فاز آبی می‌ماند، در شرایط بازی هر دو در فاز آبی باقی خواهند ماند.

روش فنل-کلروفرم ۴

با استفاده از ایزوپروپانول، RNA رسوب داده می‌شود و در مرحله‌ی آخر با اتانول ۷۰%-۸۰% شستشو و خالص‌سازی صورت می‌گیرد.
در نهایت رسوب حاصل از RNA در حجم معینی از آب فاقد RNase حل می‌شود.

نقش کلروفرم در استخراج RNA

فنل به تنهایی می‌تواند ۱۰ تا ۱۵ درصد آب را حفظ کند و به دنبال آن RNA کاهش می‌یابد، اضافه کردن کلروفرم باعث اتصال متراکم آن با فنل شده و منجر به رهاسازی آب می‌شود. ترکیب کلروفرم با فنل روند تخریب پروتئین‌ها را شدت می‌بخشد و لیپید را حل می‌کند.

پیشنهاد می‌شود برای تفکیک بهتر فاز آبی از آلی و جلوگیری از آلودگی آن با پروتئین و DNA، بعد از اضافه کردن کلروفرم میکروتیوب را به مدت ۲۰ ثانیه به شدت تکان دهید.

چطور RNase موجود در بافت و یا سلول مورد استخراج غیرفعال می‌شود؟

ایزوتیوسیانات گوانیدین موجود در معرف‌های مختلف مانند ترایزول یک ترکیب موثر در غیرفعال سازی پروتئین‌ها است که منجر به غیرفعال‌سازی آنزیم RNase می‌شود. علاوه بر این در جداسازی rRNA از پروتئین‌های ریبوزومی نقش دارد.

افزایش غلظت RNA

با کم بودن غلظت RNA می‌توان با اضافه کردن گلیکوژن مقدار آن را افزایش داد. گلیکوژن در الکل نامحلول است، می‌توان در زمان اضافه کردن الکل‌ها رسوب‌پذیری RNA را با آن افزایش داد.

نکته📝
برخی از بافت ها دارای گلیکوژن هستند که روند استخراج RNA را از آن بافت بهبود می‌بخشد. باید به این نکته توجه شود افزایش بیش از حد گلیکوژن باعث افزایش آلودگی RNA استخراج شده ( ۲۶۰/۲۳۰)می‌شود. مقدار مناسب برای اینکار یک میکرولیتر از گلیکوژن با غلظت ۲۰mg/ml است.

برای کاهش آلودگی فنولی می‌توان شستشو با اتانول ۷۵% را تکرار کرد. نشان داده شده که آلودگی با ترکیبات فنولی به برنامه‌های پایین دست آسیب چندانی نمی‌زند و قابل چشم پوشی است.

مطالب مرتبط: بررسی کمی استخراج RNA با اسپکتروفوتومتر در سلول یا بافت – روش های از بین بردن DNA ژنومی در RNA استخراج شده

خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک Real time PCR

خلاصه ای از آموزش تکنیک های استخراج RNA، سنتز cDNA و Real time PCR

در صورتی که در مشاهده ویدئو مشکل دارید اینجا یا اینجا کلیک کنید