تکنیک الایزا ELISA (Enzyme Linked Immuno sorbent Assay) یک روش ایمونولوژیکی حساس برای تشخیص و سنجش واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است. این روش جهت بررسی میزان پروتئین ها، گلیکوپروتئین ها و هورمون ها در یک نمونه بافت، سلول و یا ترشحات بدن استفاده می شود.
اساس انجام این تست اتصال آنتی بادی اختصاصی به آنتی ژن مربوطه است. نمونه هایی که به طور معمول در ELISA استفاده می شوند شامل سرم ، پلاسما ، سوپرناتانت کشت سلولی، مایعات لیز بافت و سلول ، بزاق و ادرار است.
اجزای تکنیک الایزا
۱-میکروپلیت های الایزا : پلیت های الایزا معمولا ۹۶ خانه و از جنس پلی‌استایرن، پلی پروپیلن می باشند. جنس، رنگ و خواص فیزیکی و شیمیایی آن می تواند متنوع باشد.
۲-استانداردها : معمولا برای ساخت استانداردهای الایزا از بیومولکول های بسیار خالص آن که بصورت تجاری تهیه شده، استفاده می شود. در الایزا عمدتا از ۶ رقت استاندارد استفاده می گردد هر چه تعداد رقت ها بیشتر باشد می توان مقادیر دقیق تری را ارزیابی نمود. ماتریکسی که در آن استاندارد ساخته می شود می بایست تا حد امکان به سرم انسان شبیه باشد.
۳- کونژوگه : کونژوگه ها در الایزا متنوع هستند کونژوگه هاپتن به آنزیم و کونژوگه آنتی بادی به آنزیم و یا کونژوگه آویدین به آنزیم.
آنزیمی که در تکنیک الایزا کاربرد زیادی دارد horseradish peroxidase (HRP) است. در تهیه کونژوکه آنزیم استفاده می شود به همین دلیل این ترکیبات بسیار ناپایدار بوده و لازم است در دمای بهینه حفظ شوند.
۴-سوبسترا و کروموژن : سوبسترا ماده شیمیایی است که آنزیم برروی آن بصورت اختصاصی تاثیر می گذارد، سپس با ردیابی رنگ یا ترکیبات ثانویه ایجاد شده از این واکنش، سنجش آنتی بادی یا آنتی ژن انجام می شود. کروموژن ماده ای است که تحت تاثیر مواد تجزیه شده از سوبسترا دچار تغییر رنگ می گردد. این تغییرات رنگ با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر در طول موج مورد نظر (با توجه به تغییران رنگ ایجاد شده) خوانش شده و نتایج به دست آمده با محور استاندارد مقایسه می گردد.
۵- محلول شستشو : محلولی است متشکل از بافر PBS یا Tris به همراه درصد مشخصی از یک دترجنت مانند Tween ، که در مراحل مختلف الایزا برای شستشو و در نهایت جداسازی پیوندهای غیراختصاصی متصل به چاهک مورد استفاده قرار می گیرد.
انواع الایزا
- ELISA مستقیم
- ELISA غیر مستقیم
- ساندویچ ELISA
- ELISA رقابتی
تکنیک الایزا مستقیم
در این روش آنتی ژن موجود در نمونه ای که باید تشخیص داده شود به طور مستقیم بر سطح چاهک های پلیت ۹۶ خانه پوشانده (coat) شده و آنتی بادی یا آنتی ژن مکمل آن، اضافه می گردد. به دلیل نشاندار بودن آنتی بادی متصل شده با ماده رنگ زا، آنتی ژن توسط دستگاه میکروپلیت ریدر شناسائی می شود.
در الایزای مستقیم به دلیل عدم اتصال هرگونه آنتی بادی غیر اختصاصی به پلیت از ایجاد نتایج مثبت کاذب جلوگیری می گردد. این عدم اتصال به دلیل استفاده از بافر های بلاکینگ مانند BSA ، ovalbumin ، aprotinin می باشد که نقش پوشش دهی مناطق مختلف چاهک های محل انجام تست را به عهده دارند.
به دلیل حذف واکنش متقابل آنتی بادی ثانویه و انجام مراحل کمتر در مقایسه با ELISA غیر مستقیم.، این روش استفاده گسترده تری دارد. با این حال به دلیل حساسیت پایین و هزینه بالا تر آن نسبت به سایر انواع ELISA این روش معمولا کاربرد تحقیقاتی دارد.
تکنیک الایزا غیر مستقیم
ELISA غیر مستقیم شامل دو مرحله اتصال آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ثانویه نشان دار می باشد. آنتی بادی اولیه به آنتی ژن های کف پلیت متصل شده و سپس آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می شود.
ELISA غیر مستقیم در مقایسه با ELISA مستقیم حساسیت بالاتری دارد. همچنین به دلیل استفاده از آنتی بادی های اولیه غیر متصل به ماده کروموژن، قابلیت استفاده از آنتی بادی اولیه در تست های زیادی فراهم می شود که این دلیل باعث ارزان تر و انعطاف پذیرتری انجام تکنیک می شود. تنها مشکل عمده این نوع ELISA ایجاد مثبت کاذب به دلیل واکنش غیراختصاصی بین آنتی بادی های ثانویه به سایر اجزا کف پلیت و عدم حذف در طی شستشوها می باشد.
تکنیک الایزا ساندویچی
به این دلیل الایزای ساندویچی نامیده می شود چرا که آنتی ژن ها بین دو لایه آنتی بادی قرار می گیرند.
الایزای ساندویچی دارای بالاترین حساسیت در بین انواع ELISA است. معایب عمده این نوع ELISA زمان بر بودن، هزینه بالاتر نسبت به سایر انواع الایزا است.
تکنیک الایزا رقابتی
در این نوع ELISA از دو آنتی بادی خاص استفاده می شود ، یک آنتی بادی کونژوگه با آنزیم و دیگری آنتی بادی موجود در سرم آزمایش (در صورت مثبت بودن سرم). ترکیب دو آنتی بادی در چاهک ها امکان رقابت برای اتصال به آنتی ژن را فراهم می کند. در صورت تغییر رنگ نتیجه آزمایش منفی گزارش می شود. این بدین معناست که آنتی بادی مکمل با آنزیم به آنتی ژن وصل شده است (نه آنتی بادی های موجود در سرم آزمایش). عدم وجود رنگ نشان دهنده آزمایش مثبت است (وجود آنتی بادی در سرم آزمایش) .
از الایزای رقابتی نمی توان برای بررسی نمونه های رقیق استفاده کرد. با این حال، از مزایای این روش می توان به بررسی طیف وسیعی از آنتی ژن ها در یک نمونه معین اشاره داشت.
یکی از مهم ترین چالش ها در انجام تکنیک الایزا کاهش خطاها جهت نتیجه گیری صحیح تست میباشد . شما میتوانید تمامی موارد خطاهای الایزا و راه حل آن ها را در صفحه مربوطه مطالعه نمایید.
مطالب مرتبط: تکنیک وسترن بلات – تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC
خدمات مرتبط: خدمات ژنتیک مولکولی و سیتوژنتیک – استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک Real time PCR
