آموزش جامع رنگ‌آمیزی اختصاصی تری‌کروم‌ ماسون (Trichrome masson) در آزمایشگاه بافت شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند :

مقدمه‌ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی تری‌کروم ماسون در بافت‌شناسی

رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون، مهمترین و کاربردی ترین رنگ‌آمیزی اختصاصی در آزمایشگاه پاتولوژی و بافت‌شناسی برای اندازه گیری کلاژن و فیبر جهت بررسی و تشخیص بافت های همچون پوست، قلب، کلیه، کبد، عروق می باشد.

رنگ تری‌کروم (Trichrome) از رایج‌ترین رنگ های انجام شده در آزمایشگاه بافت‌شناسی و دانشگاه ها جهت تحقیق و توسعه دانشجویان به حساب می آید. واژه تری‌کروم همانطور که از نام آن پیداست، از سه رنگ انتخابی و افتراقی تشکیل شده است. بنابریان برای انجام آن نیازمند استفاده از رنگ می باشد.

عمده این سه رنگ استفاده شده در تکنیک رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون شامل اول رنگ هماتوکسیلین که به‌واسطه آن هسته ها با همون مایر یا هماتوکسیلین توسط هریس رنگ میگیرند، دوم رنگ‌آمیزی سیتوپلاسم توسط مخلوط دقیق اسید فوشین و کولورت قرمز که رنگهای اسیدی هستند و در نهایت رنگ‌آمیزی انتخابی کلاژن با لایت گرین (light green) و گاهی اوقات با آبی آنیلین (Aniline Blue) می باشد. الیاف کلاژن با استفاده از میکروسکوپ نوری و رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون یا با استفاده میکروسکوپ فلورسانس و رنگ های نشاندار ایمونو فلورسانس مشاهده می شوند. البته برخی کیت ها تری‌کروم برای دقت بالاتر در رنگ‌آمیزی کلاژن از مواد بیشتری نیز استفاده می کنند.

---

تاریخچه رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون

اولین زمان استفاده از رنگ سه تایی در این تکنیک جهت افزایش مقایسه و بهبود شناسایی به سال ۱۸۸۰ بر می‌گردد. یکی از متدهای اولیه رنگ‌آمیزی بافت ها برای هیستولوژی توسط Claude Pierre Masson توسعه یافته است. دستور العمل های رنگ‌آمیزی تخصصی تری‌کروم ماسون تکامل یافته از فرمول اصلی Claude L. Pierre Masson (1880-1959) کاربردهای خاص متفاوتی دارند، اما همه برای تشخیص سلول ها از بافت همبند اطراف مناسب هستند.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی تری‌کروم ماسون در بافت‌شناسی

رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون جهت تشخیص و شناسایی کلاژن از ماهیچه استفاده می گردد و در تشخیص تغییرات فیبری مانند تغییرات در سیروز کبدی و بیماری های کلیوی کمک می‌کند. این تکنیک جهت تمایز و تشخیص تومورهایی که منشا آنها سلولهای ماهیچه ای مشتق شده از فیبروبلاست ها است نیز کاربرد دارد. علاوه بر این تکنیک رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون برای مطالعه و بررسی پاتولوژی های عضلانی(دیستروفی عضلانی)، آسیب‌شناسی قلبی (انفارکتوس)، آسیب شناسی کبدی (سیروز) یا آسیب شناسی کلیه (فیبروز گلومرولی) در آزمایشگاه های پاتولوژی تشخیصی و تحقیقاتی توسط پاتولوژیست ها، پژوهشگران و اساتید حوزه های بیولوژی، پیراپزشکی و پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

نگاهی اجمالی به پروتئین کلاژن رنگ شده با تری‌کروم ماسون

کلاژن (Collagen) پروتئینی است که در محیط خارج از سلولی موجودات مختلف سنتز شده و به صورت رشته های کلاژن مشاهده می‌گردد. سنتز و تولید کلاژن توسط سلول‌های استئوبلاست در استخوان، سلولهای کندروبلاست غضروف، سلول‌های ماهیچه صاف موجود در دیواره رگ های خونی و سلولهای اپیتلیال انجام می شود. عمدتا اسیدآمینه‌های موجود در کلاژن‌ها یکسان است. کلاژن در کلیه انواع بافت های پیوندی بجز خون موجود می باشد.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی تری‌کروم ماسون

رنگ‌آمیزی تری‌کروم برای بافت‌های فریز شده و بیوپسی‌های کبد و کلیه استفاده می‌گردد. بافت‌های فیکس شده در فرمالین نیز کاربرد دارد.

در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی تری کروم ماسون می‌پردازیم.

پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی تری‌کروم ماسون در بافت‌شناسی

مراحل رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون به این صورت می باشد.

1. مقاطع بافتی با ضخامت ۵ میکرومتر به وسیله‌ی دستگاه میکروتوم برش زده شده و بر روی لام های میکروسکوپی استاندارد قرار داده می شوند. لام ها را با استفاده از درجات نزولی الکل، به آب رسانده (آبدهی)، سپس در محلول بوئن به مدت یک ساعت در فور ۵۶ درجه قرار داده می شوند.
   
2. لام‌ها را با آب جاری شستشو داده تا زردی بوئن گرفته شود. سپس با آب مقطر شستشو و به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه محلول هماتوکسیلین وایگرت روی بافت ریخته می شود.
   
3. لام ها به مدت ۱۰ دقیقه با آب جاری و بعد از آن با آب مقطر شستشو و مجدد به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه در جار رنگ آمیزی لام حاوی محلول ببریچ اسکارلت – اسید فوشین قرار داده می شوند. پس از شستشو با آب مقطر، حدود ۱۰-۱۵ دقیقه محلول اسیدفسفوتنگستیک و اسیدفسفومولیبدیک را روی لام ریخته و به مدت ۲۵-۲۰ دقیقه داخل محلول آنیلین بلو قرار گرفته می شود.
   
4. نمونه ها با آب مقطر شسته و حدود ۵-۲ دقیقه در محلول اسید استیک ۱٪ آغشته می شوند. در انتها لام ها را با آب مقطر شستشو داده و آن ها را با الکل آبگیری و پس ازگذراندن از زایلن، لامل را با چسب انتلان می چسبانیم و با میکروسکوپ نوری بررسی می‌کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی آلیزارین رد

مواد مورد نیاز

• اتانول مطلق
• آب مقطر
• محلول بوئن
• زایلن
• هماتوکسیلین وایگرت
• محلول اسید استیک ۱٪
• اسیدفسفوتنگستیک
• اسیدفسفومولیبدیک
• محلول آنیلین بلو
• محلول ببریچ اسکارلت – اسید فوشین
• چسب انتلان

تجهیزات مورد نیاز

• میکروسکوپ نوری
• دستگاه میکروتوم
• جار رنگ‌­آمیزی لام
• لام و لامل
• فور

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون

نتایج رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون در تمام لام های رنگ‌آمیزی شده مطالعه بافت‌شناسی و آزمایشگاه پاتولوژی به این صورت است که :

• ✔️ فیبرهای ماهیچه ای به رنگ قرمز
• ✔️ کلاژنو استخوان را به رنگ آبی یا سبز
• ✔️ سیتوپلاسم را به رنگ قرمز روشن یا صورتی
• ✔️ هسته ها را به رنگ بنفش تیره رو به سیاه رنگ‌آمیزی می شوند.

بررسی میزان کلاژن به وسیله ی اسپکتروفتومتری

سنجش هیدروکسی پرولین مبتنی بر اسپکتروفتومتری یکی از معدود سنجش هایی است که امکان کمی سازی واقعی محتوای کلاژن و غلظت آن در چندین اندام از جمله کلیه را فراهم می کند. این سنجش برای اولین بار در سال ۱۹۵۰ معرفی شد، اساس این روش بر این پایه است که همه انواع کلاژن دارای دامین های کروی هستند و موتیف ساختاری مشترک بخش‌های مارپیچ سه‌گانه را دارند. این ساختار مارپیچ سه گانه از سه زنجیره α تشکیل شده است که از ۱۰ تا ۱۵۰ کیلو دالتون در هر زنجیره متغیر است.

هر زنجیره از یک توالی اسید آمینه سه گانه تکرار شونده (Gly-X-Y) n تشکیل شده است که X و Y می توانند هر اسید آمینه ای باشند، اما اغلب به ترتیب پرولین و هیدروکسی پرولین هستند. کلاژن یکی از معدود پروتئین های حاوی اسید آمینه هیدروکسی پرولین است. بنابراین، بر اساس کمیت مطلق هیدروکسی پرولین (که درصد ثابتی از ترکیب اسید آمینه کلاژن در اکثر اندام های پستانداران را نشان می دهد)، می توان میزان محتوای کلاژن و غلظت آن در بافت ها را به دست آورد.

اندازه گیری کلاژن جهت بررسی میزان ترمیم استخوان

استخوان بافتی حاوی کلاژن است که در طول چرخه زندگی فرد برای سازگاری با استرس مکانیکی و حفظ یکپارچگی بافت های اسکلتی بازسازی می شود. عدم تعادل بین تحلیل استخوان و تشکیل استخوان در پوکی استخوان، نقایص استخوانی همراه با ترومای شدید، برداشتن جراحی و ناهنجاری‌های مادرزادی همگی به جایگزین‌هایی برای معکوس کردن روند تحلیل استخوان و بازسازی استخوان‌ها نیاز دارند. رویکردهای سنتی ترمیم استخوان عمدتاً بر استفاده از پیوندهای استخوانی از منابع اتولوگ، آلوژنیک تمرکز دارند. با این حال، چندین عارضه مانند عوارض ناحیه اهداکننده، رد سیستم ایمنی میزبان و انتقال بیماری، کاربرد این پیوندهای استخوانی را محدود می‌کند و انگیزه ایجاد مواد زیست سازگار مصنوعی از جمله سرامیک‌ها، پلیمرها، فلزات و کامپوزیت‌ها را فراهم می‌کند. بیوسرامیک های فسفات کلسیم، مانند هیدروکسی آپاتیت (HA) و تری کلسیم فسفات، به دلیل زیست سازگاری، امکان ترمیم بافت استخوانی در مجاورت بیوسرامیک ها و شباهت شیمیایی به فاز معدنی استخوان های انسان، به طور گسترده ای به عنوان داربست های موقت برای بازسازی استخوان مورد استفاده قرار می گیرند.

ارزیابی ترمیم استخوان با استفاده از بیوسرامیک هیدروکسی آپاتیت میکرو متخلخل دو فازی کلسیم فسفات و بتاتری کلسیم فسفات در طرح های پژوهشی که در آنها ترمیم استخوان به وسیله مواد زیست سازگاری مانند بیوسرامیک های فسفات کلسیم، مانند هیدروکسی آپاتیت (HA) و تری کلسیم فسفات استفاده می شود شباهت شیمیایی به فاز معدنی استخوان های انسان مدنظر پژوهشگران است با این حال، کاربردهای بالینی این پژوهش ها با چالش هایی همچون انعطاف پذیری پلیمرهای آلی، ریزساختارهای استخوان ها و نرخ تخریب مناسب روبرو است.

ارائه خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی تری‌کروم ماسون در آزمایشگاه بافت شناسی

سلول­های هر بافتی از بدن موجود زنده یک یا چند رنگ آمیزی اختصاصی خود را دارد که مطالعه و بررسی بافت را در مسیر تحقیقات در زمینه بیماریهای مختلف آسان می کند. لازم به ذکر است یکی از خدمات ارائه شده در بخش پاتولوژی شرکت بافت و ژن پاسارگاد، رنگ­آمیزی­های تخصصی انواع بافت های انسانی و حیوانات آزمایشگاهی می باشد که با تجهیزات آزمایشگاهی استاندارد و باکیفیت ترین مواد توسط کارشناسان باتجربه انجام می شود.

مواد موجود در کیت ها تری کروم هیستوژنوتک یا بافت و ژن پاسارگاد شامل :

• ✔️ محلول بوئن 
• ✔️ محلول هماتوکسیلین وایگرت
• ✔️ محلول ببریچ اسکارلت-اسید فوشین
• ✔️ محلول اسیدفسفوتنگستیک و اسیدفسفومولیبدیک
• ✔️ محلول آنیلین بلو

آزمایشگاه بافت شناسی هیستوژنوتک با استفاده از تجهیزات مطابق با استانداردهای آزمایشگاهی در ارائه خدمات رنگ آمیزی عمومی و اختصاصی بافت شناسی آماده همکاری با محققان، دانشجویان، اساتید می باشد. با ارائه نتایج آنالیز شده، کلیپ های آموزشی و پروتکل های رنگ آمیزی آماده خدمت رسانی است. آزمایشگاه بافت شناسی هیستوژنوتک قادر است کلیه مراحل صفر تا صد رنگ آمیزی های اختصاصی بافت را روی کلیه بافت های حیوانی و انسانی ارسال شده از سوی محققان و آزمایشگاه های تشخیصی پزشکی پاتوبیولوژی انجام دهد.

جهت مشاوره رایگان با ما در تماس باشید
۰۲۱۶۶۱۲۱۹۸۸ 

---

جمع بندی

رنگ آمیزی تری کروم ماسون (Masson’s trichrome) در آزمایشگاه های بافت شناسی و پاتولوژی یکی از پر اهمیت ترین و کاربردی ترین رنگ آمیزی های بافت شناسی جهت تشخیص تمایز فیبرهای عضلانی و کلاژن در مطالعات گوناگون درمانی برای پاتولوژیست ها و طرح های پژوهشی و پایان نامه ای برای دانشجویان می باشد.

رنگ آمیزی تری کروم ماسون تمایز بین کلاژن و ماهیچه صاف در تومورها و افزایش کلاژن در بیماری هایی مانند سیروز استفاده می شود. در بافت شناسی برای تمایز فیبرهای عضلانی و کلاژن در مطالعه آسیب شناسی بافت های قلب (انفارکتوس)، کبد (سیروز)، کلیه (فیبروز گلومرولی) استفاده می شود.

در این رنگ اختصاصی عضلات و فیبرهای ماهیچه ای به رنگ قرمز، فیبرهای کلاژن به رنگ آبی یا سبز، سیتوپلاسم به رنگ قرمز روشن یا صورتی و هسته ها به رنگ بنفش تیره رنگ آمیزی می شوند

این روش همچون دیگر انواع تکنیک های بافت شناسی، نیاز به دقت و تجربه بسیار بالا و همچنین تجهیزات مناسب می باشد تا بتواند نتایجی معتبر در پی داشته باشد. شرکت بافت و ژن پاسارگاد با داشتن آزمایشگاه بافت شناسی مجهز و کادری مجرب، می تواند به آزمایشگاه های پاتولوژی و همچین دانشجویان و اساتید جهت به سرانجام رساندن طرح های پژوهشی در انجام آزمایشات پایان نامه ای در محیط مناسب کمک کند.

سوالات متداول

❔ رنگ آمیزی اختصاصی تری کروم ماسون برای رنگ نمودن کدام نمونه های بافتی استفاده می‌شود؟
✔️ رنگ آمیزی تری کروم ماسون جهت رنگ آمیزی کلاژن موجود در بافت هایی مانند پوست، قلب، کلیه، کبد و عروق کاربرد دارد.

❔ رنگ آمیزی اختصاصی تری کروم ماسون برای مطالعه کدام بیماری ها کاربرد دارد؟
✔️ این رنگ آمیزی برای بررسی و تشخیص بیماریهایی همچون سیروز کبدی، آسیب‌شناسی قلبی، دیستروفی عضلانی کاربرد دارد.