خدمات ژنتیک مولکولی و سیتوژنتیک

برخی از تکنیک های ارائه شده در هیستوژنوتک

انجام تکنیک الایزا، وسترن بلات و فلوسیتومتری
ترانسفورماسیون باکتری با وکتور با روش شیمیایی و الکتروپوریشن
کشت کلونی باکتری، تخلیص پلاسمید، ایجاد ویروس از وکتور
انجام کلونی PCR در وکتورهای بیانی
طراحی، سفارش و بررسی صحت ساخت وکتور
طراحی وکتورهای بیانی
ترانسداکشن سلول با ویروس
نشاندار کردن سلول با وکتور GFP
تولید رده سلول های نوترکیب
کلونینگ و بیان پروتئین
تکنیک SDS PAGE
رنگ آمیزی کوماسی بلو

امروزه با توجه به افزایش تحقیقات در علم ژنتیک به ویژه در کشور ما، کاربرد انواع تست های ژنتیکی در زمینه های تحقیقات سلول های بنیادی، تشخیصی، درمانی، پیش آگهی و بسیاری از حوزه های دیگر از اهمیت بسزایی برخوردار می باشد. آزمایشگاه تحقیقاتی بافت و ژن پاسارگاد هیستوژنوتک بر آن است تا پس از معرفی مختصری از انواع تستهای ژنتیکی بر اساس هدف کاربردی آن ها، به معرفی فرآیندها، کاربردها، معایب و مزایای برخی از پرکاربردترین تستهای ژنتیکی در دو حوزه سیتوژنتیک و ژنتیک ملکولی بپردازد.

از این رو در حوزه سیتوژنتیک به معرفی تست های دستکاری ژنتیکی، فلوسیتومتری، FISH، CGH و در حوزه ژنتیک ملکولی به انواع روش های مبتنی بر PCR، کمی سازی PCR و تکنیک های نسل جدید توالی یابی (NGS) پرداخته می شود.

خدمات ژنتیک مولکولی و سیتوژنتیک

برخی از تکنیک های ارائه شده در هیستوژنوتک

انجام تکنیک الایزا، وسترن بلات و فلوسیتومتری
ترانسفورماسیون باکتری با وکتور با روش شیمیایی و الکتروپوریشن
کشت کلونی باکتری، تخلیص پلاسمید، ایجاد ویروس از وکتور
انجام کلونی PCR در وکتورهای بیانی
طراحی، سفارش و بررسی صحت ساخت وکتور
طراحی وکتورهای بیانی
ترانسداکشن سلول با ویروس
نشاندار کردن سلول با وکتور GFP
تولید رده سلول های نوترکیب
آموزشی کلونینگ ژن با پروتئین
تکنیک SDS PAGE
رنگ آمیزی کوماسی بلو

به دلیل استفاده روز افزون از فرآورده های طبیعی، مصرف انواع عصاره ها و اسانس های بدست آمده از گیاهان دارویی، امروزه بسیار حائز اهمیت است. تـأکید سـازمـان بـهـداشـت جهانـی بر جایگزینــی تدریجـی مواد مؤثـره طبیعی به جای مواد مؤثره شیمیایـی در صنایع غذایی، بـهداشتی ـ آرایشی و به ویژه دارویی موجب شده تا کشورهای گوناگون به سرمایه‌گذاری و برنامه‌ ریزی برای تولیـد مـحصولات صنعتی با پایـه طبیعـی اهـتمام ورزند.

گیاهـان، مـنابـع غنـی و متنوعـی از رنگ‌های خوراکی، آنتی‌اکسیدان‌ها، طعم‌دهنده‌ها، مواد معطر و عصاره‌ها بوده و می‌توانند تأمین کننده نیازهای صنایع دارویی و شیمیایی باشند. مرکز تحقیقات علوم پایه پزشکی بافت و ژن پاسارگاد هیستوژنوتک این بخش را با هدف تـجاری سـازی یافتـه های پـژوهشـی و تـولید انـواع عـصاره ها و مـواد مـوثـره گیاهــی آغاز کرده است.

خدمات مطالعات ژنتیک مولکولی

خدمات ژنتیک مولکولی

تکنیک SDS PAGE

تکنیک وسترن بلات

نشاندار کردن سلول با وکتور GFP

ترانسفورماسیون باکتری با وکتور

کشت کلونی باکتری و تخلیص پلاسمید

انجام کلونی PCR در وکتورهای بیانی

ترانسداکشن سلول با ویروس

تکنیک SDS PAGE

تکنیک وسترن بلات

نشاندار کردن سلول با وکتور GFP

ترانسفورماسیون باکتری با وکتور

کشت کلونی باکتری و تخلیص پلاسمید

انجام کلونی PCR در وکتورهای بیانی

ترانسداکشن سلول با ویروس

رنگ آمیزی کوماسی بلو

رنگ‌آمیزی کوماسی بلو ( Coomassie blue ) خانواده‌ای از رنگ‌هاست که معمولاً برای رنگ‌آمیزی پروتئین‌ها در ژل‌های SDS-PAGE استفاده می‌شوند. برای آشکارسازی پروتئن‌ها پس از انجام الکتروفورز، ژل‌های SDS-PAGE در رنگ خیسانده می‌شوند و سپس رنگ اضافی با یک حلال (رنگ بر) پاک می‌شوند. این روش امکان نمایان شدن پروتئین ها را به صورت نوارهای آبی در زمینه ای روشن فراهم می‌کند. در اکثر پروژه‌های تحقیقاتی، بررسی بیان پروتئین با روش وسترن بلات با هدف تعیین غلظت یک پروتئین و همچنین بررسی وجود و یا عدم وجود یک آنزیم و یا هورمون خاص، در نمونه‌های مختلف زیستی صورت می گیرد. در پروژه‌های دانش بنیان، به منظور تولید محصولات بیوتکنولوژی و یا طراحی دارو، استفاده از رنگ کوماسی بلو جهت رنگ‌آمیزیِ وجودِ پروتئین، می‌تواند در سریع‌ترین زمان ممکن به محقق، نتیجه فعالیت پژوهشی را نشان دهد. هیستوژنوتک در بخش آزمایشگاه پروتئین خود با استفاده از این رنگ در مراحل بررسی پروتئین، پروژه‌های متعددی را در حال اجرا دارد. در رنگ آمیزی کوماسی بلو از محلول آمونیوم سولفات، کوماسی بلو، محلول اورتو فسفریک اسید و اتانول استفاده می‌شود. این روش در کمتر از دو ساعت، پروتئین‌ها را در یک زمینه تمیز رنگ آمیزی می‌کند.

تولید رده سلول های نوترکیب

پیشرفت در فناوری DNA نوترکیب منجر به گسترش دانش ما در مورد مکانیسم‌های مولکولی تکثیر ویروس، شده است. تکثیر ویروس‌ در سلول‌ها در نتیجه تعاملات پیچیده بین عوامل مرتبط با ویروس، عوامل رمزگذاری شده با ویروس و عوامل سلول میزبان، رخ می‌دهد. این تعاملات پیچیده نیاز به تخصص در رشته‌های مختلف به منظور دستیابی به بالاترین اثربخشی در عملکرد سلول دستکاری شده دارد. در آزمایشگاه مولکولی و ویروس شناسی هیستوژنوتک، متخصصین رشته‌های مختلف در گرایش‌های بیوتکنولوژی، باکتریولوژی، میکروبیولوژی، بیوشیمی و سلولی- مولکولی در یک تعامل هماهنگ موفق به تولید رده‌های مختلف سلول‌های ترانسژنیک یوکاریوتی شده‌اند که می توان از آنها جهت بررسی اثرات القائی پروتئین‌های ترشحی حاصل از سلول‌های نوترکیب بر سایر رده‌های سلولی استفاده کرد. به دلیل نقش کلیدی پروتئین‌های ترشحی حاصل از سلول‌های دستکاری شده در تولید داروهای نوترکیب و انواع آنتی بادی‌ها مونوکلونال در بسیاری از مطالعات بالینی و پیش بالینی مورد توجه محققین و شرکت‌های داروسازیِ فعال در این حوزه قرار گرفته است. این سلول‌های نوترکیب را می‌توان جهت کارهای درمانی، تشخیصی و یا تولیدی به صورت بانک سلولی ذخیره کرد.

طراحی وکتورهای بیانی

اکثر پروتئین‌های نوترکیب را می‌توان با شبیه‌سازی ژن‌های مربوطه در حاملین ژن یا وکتور تولید کرد. در بخش مولکولی آزمایشگاه بافت و ژن پاسارگاد، طراحی وکتورهای بیانی با سازه متنوع ژنی، جهت دستیابی به سطوح بهینه بیان پروتئین نوترکیب انجام می شود. در فرآیند تولید محصولات دانش بنیادی با استفاده از سلول‌های تراریخت یا دستکاری شده، افزایش سرعت تولید و کاهش هزینه می‌تواند در موفقیتِ دستیابی به محصول، اثرگذار باشد که این امر در نتیجه طراحی یک وکتور با جزئیات دقیق حاصل می شود. به این ترتیب در طی طرح‌های مختلف پژوهشی با ارائه تجهیزات آزمایشگاهی با سطح تکنولوژی بالا، می‌توان با به حداکثر رساندن بازده فرآیند تولید پروتئین نوترکیب، بر عملکرد پروتئین تولید شده و اثربخشی اتصال پروتئین به گیرنده خود در بافت هدف تاثیر گذاشت. طراحی انواع وکتور با پایه لنتی ویروس، رتروویروس، آدنوویروس و سایر محصولات متنوع تراریختی در آزمایشگاه‌های بیوتکنولوژی هیستوژنوتک صورت می‌گیرد.

طراحی، سفارش و بررسی صحت ساخت وکتور

از آنجا که طراحی وکتورهای بیانی (مخمری و باکتریایی) نیازمند تخصص و تسلط به علم بیوانفورماتیک دارد، آزمایشگاه سلولی و مولکولی هیستوژنوتک با انجام خدمات بیوانفورماتیک و تحلیل کامپیوتری، این توانایی را دارد که با طراحی یک وکتور خاص ساختار یا عملکرد وکتور حامل قطعات ژنی را پیش‌بینی کند. دانش طراحی پرایمر مناسب جهت ردیابی قطعه ژنی هدف در یک وکتور، نیاز به تجربه بالائی در حوزه سلولی مولکولی داشته که متخصصین بخش مولکولی آزمایشگاه بافت و ژن پاسارگاد با انجام مشاوره‌های رایگان در این زمینه، دستیابی به دقیقترین نتایج تحقیقاتی و دانشجویی حوزه بیوتکنولوژی را فراهم نموده است. به علاوه ساخت الیگونوکلئوئیدهای مورد نیاز در طراحی پرایمر در فرآیند تائید صحت عملکرد قطعه ژنی در وکتور، می‌تواند در میزان پروتئین ترشحی و اثربخشی آن، کمک بزرگی در تولید محصولات فن آورانه پژوهشگران را تامین نمایید.

انجام تکنیک الایزا

تست الایزا (Enzyme-linked immuno_sorbent assay) یکی از پرکاربردترین تکنیک ایمونواسی می باشد که جهت شناسائی یک آنتی‌ژن در ترشحات سلولی، سرم و یا پلاسمای خونی استفاده می‌شود. در این تکنیک، آنتی‌بادی شناساگر به آنزیم متصل می‌گردد. حضور آنتی بادی و یا آنتی ژن و یک آنزیمِ درگیر در این قرآیند منجر به تولید سیگنال می‌شود. به منظور بررسی آنتی‌ژن‌های موجود در یک نمونه، نیاز به آنتی‌بادی‌های شناساگر داشته، که در آزمایشگاه هورمون و بیوشیمیائی شرکت بافت و ژن پاسارگاد، این آنتی‌بادی‌ها موجود می‌باشند. انواع مختلف آنتی بادی های پلی‌کلونال و مونوکلونال برای بررسی گونه‌های مختلف موش سوری، موش صحرائی یا رت، خرگوش و انسان موجود می‌باشد. این تنوع آنتی‌بادی در بانک آنتی‌بادی هیستوژنوتک، امکان بررسی سرم، پلاسما و یا عصاره لیز سلولی در پروژه های تحقیقاتی مختلف، در مطالعات اساتید دانشگاه، یا دانشجویان کارشناسی ارشد و دکتری را میّسر کرده است. در اکثر مطالعات دانشجوئی از نمونه‌های سرم خون یا پلاسمای حیوانات آزمایشگاهی استفاده می‌شود که بسته به هدف و نوع آنالیت مورد سنجش انواع مختلف الایزا شامل: مستقیم، غیرمستقیم، ساندویچی و الایزا رقابتی طراحی شده اند.

انجام تکنیک فلوسیتومتری

فلوسایتومتری روشی دقیق با کارایی بالا جهت شناسایی سلول‌ها ( ذرات) و ارزیابی خصوصیّات آنها می‌باشد. هر سلولی بر حسب نوع و تخصصی که بر عهده دارد مولکول مختص به خود را در سطح یا درون سیتوپلاسم بیان می‌کند. به این ترتیب سلول‌ها برحسب وظیفه‌ای که در طی تمایز بر عهده می‌گیرند و بر حسب محیطی که در آن قرار دارند، مارکر خاصی را در سطح خود بیان می‌کنند که با تکنیک فلوسیتومتری قابل شناسائی می‌گردد. در آزمایشگاه مولکولی هیستوژنوتک با داشتن بانک آنتی‌بادی متنوع جهت ردیابی انواع رده‌های سلولی نرمال، سرطانی، تمایز یافته، دستکاری شده (ترانسژنیک) و یا ردیابی پروتئین‌های سلولی، با تکنیک فلوسیتومتری میسر شده است. بررسی پروتئین اختصاصی سطح سلولی، داخل سیتوپلاسمی و یا هسته‌ای در پایان‌نامه‌های دانشجوئی در مقاطع مختلف تحصیلی کارشناسی ارشد و دکتری یکی از دغدغه‌های دانشجویان بوده و لذا وجود بانک غنی از آنتی‌بادی‌ها، می‌تواند روند اجرای انواع طرح های پژوهشی را میّسر سازد. آنتی‌بادی‌های اولیه و ثانویه متصل (کونژوگه) با رنگ فلورسانس می‌توانند مولکول‌های سطحی و یا ترکیبات داخلی سلول‌ها را ردیابی کرده و به آنها متصل شوند و شناسایی انواع سلول‌های موجود در یک جمعیت سلولی متنوع را امکان پذیر سازند.

نشاندار کردن سلول با وکتور GFP

یکی از جدیدترین روش‌ها برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب استقاده از ژن‌های گزارشگر در هنگام طراحی وکتور می‌باشد. از این وکتورها می‌توان برای ردیابی بیان ژن مورد نظر در کشت سلول، باکتری یا مخمر استقاده گردد. وکتورهایی که حامل ژن ردیاب پروتئین فلورسنت سبز (GFP) هستند غالباً به عنوان ژن ریپورتر یا گزارشگر بیان ژن‌های کلون شده در وکتور و یا برای ردیابی سلول‌های بنیادی در داخل بدن (In vivo) بکار برده می‌شوند. در آزمایشگاه بیوتکنولوژی هیستوژنوتک، با استفاده از لیپوفکتامین، سلول های یوکاریوتی رده‌های مختلف نرمال و سرطانی با وکتورهای حاوی GFP در پایان نامه‌های دکتری و کارشناسی ارشد در رشته‌های مختلف علوم پایه پزشکی و یا علوم بین رشته‌ای، ترانسداکت شده و پس از بررسی در زمان‌های مختلف پس از آلوده‌سازی سلول‌ها با ویروس، میزان بیان GFP و تعداد سلول‌های بیان مثبت، شمارش و میزان کارائی روش ترانفکشن و ترانسداکشن ارزیابی می‌شود. بیان پروتئین GFP در حیوانات ترانسژنیک نیز می‌تواند در نسل های بعدی سلول‌های حیوان مدل سازی شده نیز ارزیابی گردد.

تولید رده سلول های نوترکیب

طراحی وکتورهای بیانی

طراحی، سفارش و بررسی صحت ساخت وکتور

انجام تکنیک الایزا

انجام تکنیک فلوسیتومتری

شاید جواب سوال خود را بیابید

سوال های متداول مشتریان

در صورت عمل نکردن وکتور طراحی شده در داخل سلول، چه ایراداتی را باید اصلاح کرد؟

عمل نکردن وکتور با چند روش قابل تشخیص می باشد. وکتور ترانسفورم شده در باکتری باید ژن مقاومت به آنتی بیوتیک (Selective marker) داشته باشد. به این ترتیب در صورت عمل نکردن، نمی تواند در محیط حاوی آنتی بیوتیک رشد کند. وکتور باید ژن گزارشگر (Reporter gene) داشته باشد تا پس از عمل کردن ژن هدف در یوکاریوت قابل مشاهده در زیر میکروسکوپ باشد. در صورت طراحی اشتباه و یا در نظر نگرفتن جایگاه های برش آنزیمی صحیح در وکتور، یا انتخاب وکتور نامناسب متناسب با سازه مورد نظر و یا انتخاب میزبان نامناسب جهت ترشح پروتئین، وکتور عمل نخواهد کرد و باید هر کدام از موارد مجددا ارزیابی شود.

برای تغییر در میزان بیان یک ژن از چه وکتورهائی می‌توان استفاده کرد؟

وکتورهای بیانی (Expression vectors) پلاسمیدهایی هستند که برای بیان ژن مورد نظر در میزبان سلولی استفاده می شوند. انتخاب وکتور بیانی مناسب کلید موفقیت پروژه های توسعه محصول تحقیقاتی و بیوتکنولوژی است. به این ترتیب براساس نوع پروتئین و میزبان مورد استفاده پروکاریوتی و یوکاریوتی، طراحی توالی سازه قرار گرفته در وکتور تحت پروموتورهای مختلف می تواند بر میزان پروتئین تولیدی اثرگذار باشد. به علاوه نوع وکتور پایه شامل لنتی ویروس ها، رتروویروس ها، آدنوویروس ها و دیگر انواع وکتورهای پایه می تواند در کارائی تکنیک موثر باشد.

به منظور افزایش میزان بیان یک پروتئین نوترکیب چه راه‌هائی وجود دارد؟

پروموتر القا لاک (lac promoter) یکی از رایج ترین پروموترهای مورد استفاده برای بیان پروتئین هترولوگ در E.coli است. ایزوپروپیل-β-D-تیوگالاکتوزید (IPTG) در حال حاضر کارآمدترین القاکننده مولکولی برای تنظیم فعالیت رونویسی این پروموتر است. با استفاده از IPTG می توان میزان پروتئین ترشحی در پروکاریوت را افزایش داد. این ترکیب مشابه الولاکتوز به عنوان یک متابولیت لاکتوز بوده که رونویسی اپرون لاک را تحریک می کند و بنابراین برای القای بیان پروتئین E.coli در جایی که ژن تحت کنترل اپراتور lac است، استفاده می شود.

تست‌های ضروری و متداول در طی دستکاری ژنوم یک سلول چه هستند؟

به منظور دستکاری ژنوم یک سلول یوکاریوتی و پروکاریوتی مراحل مختلفی وجود دارد که باید دقیق و به ترتیب انجام شود. پس از قرارگیری سازه در یک وکتور ویروسی، جهت افزایش غلظت، وکتور در باکتری ترانسفورم می شود این مرحله به شکل شیمیائی یا الکتریکی بوده و پس از ترانسفورم و کشت باکتری، کلون های مثبت جداسازی شده و نهایتا باکتری های مثبت تکثیر و پلاسمید تخلیص می شود و با ترانسداکشن در سلول یوکاریوتی، منجر به تغییر در ژنوم می شود. در مرحله ترانسورماسیون، تست های کلونی PCR برای بررسی حضور وکتور در باکتری، تست PCR برای تائید حضور قطعه مورد نظر در داخل وکتور، پس از ترانسداکشن مشاهده GFP به عنوان ریپورتر ژن با میکروسکوپ فلورسانت، جهت بررسی میزان پروتئین ترشحی از تست الایزا و وسترن بلات و بررسی تست های عملکردی در In vitro و In Vivo استفاده می شود.

به منظور ارزیابی بیان پروتئین در یک سلول دستکاری شده، چه تکنیک‌های مورد نیاز می باشد؟

به منظور ارزیابی ترشح پروتئین در یک سلول دستکاری شده در ابتدا با مشاهده بیان ژن گزارشگر یا Reporter gene که عموما GFP است، می توان عملکرد ژن را تخمین زد. از طرفی ژن بیان شده و پروتئین ترشحی حاصله با استفاده از تکنیک های الایزا از نظر غلظت و با استفاده از تکنیک SDS-Page و وسترن بلات از نظر درستی وزن مولکولی و میزان خلوص بررسی می شوند. به علاوه پروتئین با استفاده از اثرات ناشی از عملکرد مسیرهای آبشار ژنی، برخی از مولکول های درون سلولی را فعال و برخی را تحریک می کند که با تکنیک های مولکولی نظیر PCR قابل بررسی می باشد.

در روند طراحی وکتور به چه نکاتی باید توجه داشت؟

در طراحی یک وکتور چندین نکته قابل ملاحظه وجود دارد که شامل انتخاب صحیح وکتور پایه براساس میزبان نهائی می باشد. به این ترتیب در ابتدا توالی سازه مورد نظر از سایت NCBI به عنوان کتابخانه ژنومی مشاهده و بخش درگیر در ساخت پروتئین از کدون آغاز تا کدون پایان به همراه جایگاه های برش آنزیم های محدودالاثر (Restriction Enzyme) در نظر گرفته می شود. سپس توالی برای ساخت و قرار گرفتن در وکتور حلقوی سفارش داده می شود.

انتخاب باکتری حاوی وکتور مورد نظر از چه طریقی انجام و تائید می‌شود؟

باکتری به عنوان یک میزبان برای هدف تکثیر وکتور و یا به منظور استفاده در ترشح پروتئین هدف مدنظر می باشد. به طور طبیعی باکتری ها نسبت به بسیاری از آنتی بیوتیک ها حساس می باشند. لذا برای انتخاب باکتری حاوی ژن هدف در طراحی وکتور، یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک قرار داده می شود که سلکتیو مارکر (Selective Marker) نامیده می شود. این ژن در صورت حضور در باکتری، منجر به بقا باکتری در شرایط کشت حاوی انتی بیوتیک شده و باکتری می تواند تکثیر یابد. به این ترتیب از سایر باکتری ها تفکیک و کلونی تشکیل می دهد که با روش Colony PCR می توان حضور قطعه مورد نظر را در باکتری تائید نمود.

سلو‌ل‌های حاوی GFP تا چه مدت در بدن قابل ردیابی می‌باشند؟

Green Fluorescent protein (GFP) به عنوان یک ژن گزارشگر در طی ترشح یک پروتئین در سلول میزبان، یا به عنوان یک ردیاب (Cell Tracker) در مطالعات درون تنی (In Vivo) استفاده می شود. در صورتی که ژن مربوط به این پروتئین تحت پروموتور طراحی شده در یک وکتور بیانی، در داخل ژنوم سلول به صورت Permanent (دائمی) قرار گیرد، با هر بار تقسیم سلول، ژن مورد نظر به ارث می رسد و به صورت ماندگار قابل مشاهده خواهد بود. ولی در صورتی که وکتور به صورت Transient (گذرا) در داخل ژنوم قرار گرفته باشد در طی یک مدت محدود فعال و در نهایت با حذف عملکرد وکتور، GFP نیز حذف می شود.