تکنیک Nested PCR چیست؟
Nested PCR یکی از روش های PCR است که برای افزایش حساسیت و اختصاصیت این واکنش طراحی شده است. این واکنش شامل استفاده از دو مجموعه پرایمر خارجی و داخلی علیه یک توالی هدف در دو واکنش متوالی PCR است.
Nested PCR شامل دو واکنش PCR متوالی است که پرایمر خارجی در دور اول با توجه به توالی هدف پرایمر ها قطعه ای از DNA را تکثیر می کنند. در دور دوم محصول واکنش PCR دور اول به عنوان الگو استفاده شده و پرایمر های داخلی با اتصال به الگو به هیچ پرایمر دایمر یا محصول غیر اختصاصی تولید شده در دور اول PCR، متصل نشده بنابراین به حفظ اختصاصیت PCR از طریق تعداد زیادی از چرخه‌های ترکیبی PCR اولیه و ثانویه کمک می‌کنند.
مطالب مرتبط: اصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) – انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR
انواع Nested PCR
روش سنتی برای Nested PCR این بود که تعدادی چرخه PCR را با استفاده از اولین مجموعه پرایمرها انجام می دادند و سپس ظرف واکنش را باز کرده و مجموعه پرایمرهای دوم را برای اجرای چرخه دوم PCR اضافه می کردند. مشکل اصلی این روش، آلودگی آمپلیکون در آزمایشگاه و در نتیجه از دست دادن ویژگی سنجش است. برای رسیدگی به این موضوع، واکنش‌های تک لوله‌ای (STNPCR) ایجاد شده‌اند، که در آن هر دو مجموعه پرایمر به ظرف واکنش اولیه اضافه می‌شوند ودر کل یک PCR انجام می‌شود.
محصولات این واکنش PCR با الکتروفورز کردن مخلوط واکنش در ژل آگارز و رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید ۲% همراه با نشانگر وزن مولکولی مشاهده می‌شود.
تکنیک Semi-Nested PCR
در این روش که نتایج آن مشابه Nested PCR است، باز هم دو واکنش PCR انجام می شود ولی با این تفاوت که در هر واکنش از یک پرایمر داخلی و یک پرایمر خارجی استفاده می کنیم.
این تکنیک راه حل مناسبی برای حذف باند های کاذب، در مواقعی که امکان طراحی مجدد پرایمر وجود ندارد، است.
تکنیک Semi-Nested PCR به خصوص برای اهداف کلونینگ که اندازه ی آمپلیکون (قطعه insert) از اهمیت بالایی برخوردار است، استفاده می شود.
نحوه انجام تکنیک Nested RT-PCR
اگرچه RT-PCR یک تکنیک بسیار حساس است، می‌توان با انجام RT-PCR Nested حساسیت آن را بیشتر افزایش داد. این تکنیک شامل گرفتن مقدار کمی از محصول از RT-PCR اولیه، و استفاده از آن به عنوان یک الگو برای دور دوم PCR است. برای جلوگیری از تشکیل محصولات غیر اختصاصی یا پرایمر-دایمر در PCR دور اول، مجموعه متفاوتی از پرایمرها در PCR ثانویه استفاده می شود. این پرایمرها (Inner primers) جایگاهی درون پرایمرهای مورد استفاده در PCR اولیه (Outer primers) دارند و آمپلیکون تا حدودی کوتاه تری تولید می‌کند و از آنجا که توالی آن با مجموعه اولیه پرایمرها (Outer primers) متفاوت است، باعث تولید محصولات غیراختصاصی در PCR اولیه نمی شود، و این امکان را می دهد که اختصاصیت محصول در تعداد بالای چرخه های PCR های اولیه و ثانویه حفظ شود.
مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت – سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافت
کاربرد های تکنیک Nested PCR
برای افزایش حسایت آزمایشات، Nested PCR در بسیاری از واکنش های PCR استفاده می شود. Nested PCR به خصوص برای سنتز نمونه های اسید نوکلئیک غیر بهینه، مانند نمونه های استخراج شده از بافت های تثبیت شده با فرمالین که در پارافین قالب گیری شده اند، مناسب است.
Nested PCR برای تشخیص میکروارگانیسم ها زمانی که مقادیر بسیار کمی نمونه در دسترس باشد ارزشمند است. برای مثال در تشخیص باکتری ها از جنس های ریکتزیا، بارتونلا و ارگانیسم های مشابه در خون و بافت و تشخیص هرپس ویروس ها و انتروویروس ها در مایع مغزی نخاعی (CSF)، و تشخیص M.tuberculosis در نمونه های خلط استفاده می شود.
مزایای تکنیک Nested PCR
تکثیر مقادیر کم DNA – کاهش تکثیر اختصاصی توالی هدف (حذف باند کاذب)
محدودیت ها و مشکلات تکنیک Nested PCR
احتمال بالای آلودگی
حساسیت بالای Nested PCR با مشکلاتی نیز همراه است. این نوع PCR به دلیل دست ورزی بیشتر بسیار حساس به آلودگی است. آلودگی بیشتر در هنگام انتقال محصول دور اول به لوله دوم برای تکثیر قطعات نهایی رخ می دهد.
پرهزینه بودن
این روش PCR همچنین هزینه بیشتری دارد زیرا شامل استفاده از دو واکنش جداگانه برای رسیدن به یک نتیجه است. اگر زمانی که آلودگی اتفاق می افتد، واکنش ها تکرار شوند، هزینه به طور چشمگیری افزایش می یابد.
مطالب مرتبط: آموزش جامع طراحی پرایمر – نحوه انجام تکنیک ژل الکتروفورز
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR
