تکنیک فلوسایتومتری

فلوسایتومتری توانایی اندازه گیری ویژگی های نوری و فلورسانس سلول یا هر ذره دیگری مانند میکروارگانیسم ها، هسته ها و کروموزوم ها را دارد. اندازه، گرانولیته و ویژگی های فلورسنت سلول ها و آنتی بادی ها یا رنگ ها از پارامترهای مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل و تمایز سلول ها هستند.

اساس فلوسایتومتری

فلوسایتومتری بر پایه پراش نوری و انتشار فلورسانس است که از منبع نور (معمولاً پرتو لیزر) به ذرات متحرک (نمونه مورد بررسی) برخورد می کند و به صورت نور ساطع می شود. داده های به دست آمده می تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد جنبه های بیوشیمیایی، بیوفیزیکی و مولکولی ذرات بدهد. پراش نور، ارتباط مستقیم با خواص ساختاری و مورفولوژیکی سلول دارد، در حالی که نشر فلورسانس حاصل از یک پروب فلورسانس با مقدار پروب فلورسنت متصل شده به سلول یا اجزای سلولی متناسب است.

ترکیب فلورسنت (فلوروکروم) چیست؟

یک ترکیب فلورسنت طیفی از طول موج های خاص دارد که در آن طول موج ها انرژی نور را جذب می کند. این جذب نور باعث می شود که الکترون از حالت پایه به حالت بالاتر سطح انرژی (حالت برانگیخته) برود. الکترون برانگیخته، به سرعت به حالت اولیه خود باز می گردد و انرژی اضافی را به صورت فوتون نور ساطع می کند. این انتقال انرژی فلورسانس نامیده می شود. تعداد ترکیبات فلورسنت ذاتی در سلول محدود است.

برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

سلول ها معمولا با پروب های فلورسنت رنگ آمیزی می شوند. پروب های فلورسنت در طیف وسیعی از کاربردها مانند شناسایی جمعیت های مختلف سلولی، گیرنده های سطح سلولی یا اندامک های درون سلولی، دسته بندی سلول ها، ایمونوفنوتایپ، تعیین محتوای اسید نوکلئیک، اندازه گیری فعالیت آنزیمی و جمعیت سلولی آپوپتوز شده استفاده می شوند.

مطالب مرتبط: انواع آنتی اکسیدان ها و رادیکال های آزاد – تولید آنتی بادی های مونوکلونال

ویژگی های مهم فلوروکروم وجود یک طیف جذبی است که ترکیب فلورسنت می تواند در آن طیف برانگیخته و طیفی از طول موج ها را ساطع کند که نشر فلورسانس نامیده می شود. طول موج نشری هر فلوروکروم همیشه بیشتر از طول موج برانگیختگی آن می باشد. از آنجا که رنگ نور جذبی و نشری متفاوت است، با استفاده از فیلترهای نوری از یکدیگر جدا می شوند.

چندین آشکارساز (detector) اطراف نقطه ای که جریان مایع حاوی ذرات و سلول ها از پرتوی نور عبور می کنند، وجود دارد. یکی از این آشکارساز ها در راستای پرتوی نور است و برای اندازه گیری Forward Scatter یا FSC استفاده می شود. آشکارساز دیگر عمود بر جریان قرار می گیرد و برای اندازه گیری پراکندگی جانبی side scatter یا SSC استفاده می شود. با استفاده از اندازه گیری های نوری، اطلاعات مختلف درمورد ساختار فیزیکی و شیمیایی سلول ها جمع آوری می شود. به طور کلی، FSC میتواند حجم سلول را آشکار کند در حالیکه SSC پیچیدگی داخلی ذرات مثل محتوای گرانولی سیتوپلاسم یا ساختار هسته ای را منعکس می کند.

انواع فلوسایتومتری

دو نوع مختلف فلوسایتومتری وجود دارد که Non-sorting و sorting نامیده می شوند. نوع non-sorting فقط پراش نوری و نشر فلورسنت را انجام می دهد، در حالی که نوع sorting توانایی دسته بندی ذرات را هم دارد. FACS (Flourescence activated cell sorter) نوع دیگری از فلوسایتومتری است که توانایی دسته بندی سلول های نشاندار شده با فلورسانس از یک جمعیت سلولی مخلوط را دارند.

برای اطلاع از آنتی بادی های موجود و قیمت تست فلوسایتومتری اینجا کلیک کنید

اجزای دستگاه فلوسایتومتری

اجزای اصلی فلوسیتومترها و سورترهای سلولی اساساً شامل:

• فلوئیدیک (Fluidics)
• اپتیک (Optics)
• شبکه الکترونیکی (Electronic netrwork)
• دتکتورها و کامپیوتر

بخش فلوئیدیک مسئول هدایت مایع حاوی ذرات به سمت منبع نور متمرکز است. بخش اپتیک منبع نور را روی سلول ها یا ذرات متمرکز می کند، در حالیکه دتکتورها با جمع آوری پراش نوری یا نور فلورسانس ذرات را به شبکه الکترونی منتقل می کند. شبکه الکترونیکی سیگنال را تقویت و به یک داده های دیجیتال که متناسب با شدت نور است، تبدیل می کند.

فلوسایتومتری در موارد مختلفی برای تشخیص آنتی ژنهای غشایی، سیتوپلاسمی و هسته ای، سلول ها و اجزای سلولی مانند اندامک ها، هسته ها، DNA، RNA، کروموزوم ها، سیتوکین ها، هورمون ها و محتوای پروتئین نیز می تواند به کار رود. کاربرد دیگر فلوسایتومتری؛ تجزیه و تحلیل تکثیر سلولی و چرخه سلولی، اندازه گیری انتشار کلسیم و پتانسیل غشاء می باشد.

انواع فلوروکروم ها

فلوروکروم های مورد استفاده در فلوسایتومتری به چند دسته تقسیم می شوند؛ فلوروکروم هایی که برای نشاندار کردن پروتئین ها به صورت کووالانسی استفاده می شوند، فلوئوروکروم برای اسیدهای نوکلئیک و مولکول های گزارشگر برای نشاندار کردن پروتئین ها به صورت کووالان، معمولا پروب به صورت یک آنتی بادی انتخاب می شود.

مطلب مرتبط: آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی – تولید آنتی بادی های پلی کلونال

فلوروکروم های مورد استفاده در فلوسایتومتری

پرکاربردترین فلوروکروم ها برای نشاندار کردن آنتی بادی ها شامل FITC، فیکواریترین (PE) و آلوفیکوسیانین (APC) می باشد. تکامل رنگ های tandem، حاوی دو فلوروکروم، تعداد پروتئین های نشاندار شده را افزایش داده است. به عنوان مثال، ترکیبات کونژوگه شده PE و APC با رنگ های مختلف سیانین، مثل PE-Cy 5 و APC-Cy7 از این دست فلروکروم ها هستند. در رنگ های tandem، زمانی که اولین رنگ برانگیخته می شود و به حداکثر جذب خود می رسد، تمام انرژی خود را به رنگ دوم که در مجاورت آن است منتقل می کند. فلوروکروم دوم فعال شده و نشر فلورسانس تولید می کند. این فرایند انتقال انرژی رزونانس الکترون (FRET) نامیده می شود.

فلوروکروم هایی که برای رنگ آمیزی اسیدهای نوکلئیک استفاده می شوند کاربردهای اصلی از جمله اندازه گیری مقدار DNA ، ارزیابی یکپارچگی DNA سلولی ، اندازه گیری پلوئیدی و تجزیه و تحلیل چرخه سلولی دارند. در حال حاضر رنگ های زیادی وجود دارند که می توانند هم RNA و هم DNA را رنگ آمیزی کنند به عنوان مثال اتیدیوم بروماید (EB) و PI را نام برد. EB و PI بین بازها در اسید نوکلئیک دو رشته ای قرار می گیرند. PI توسط نور آبی برانگیخته می شود و فلورسانس قرمز ساطع می کند.

از مولکول های گزارشگر (Reporter) نیز در فلوسایتومتری استفاده می شود. برای مثال، پروتئین فلورسانت سبز (GFP) در طول موج ۴۸۸ بر انگیخته می شود و نور سبز منتشر می کند. GFP و اشکال جهش یافته آن در موارد مختلفی مثل تعیین سلول های ترانسفکت شده با GFP استفاده می شوند.

مولکول گزارشگر دیگر رنگ JC-1 است که برای اندازه گیری پتانسیل غشای میتوکندری استفاده می شود. رنگ JC-1 در میتوکندری سلول های سالم تجمع می یابد و JC-1 در طول موج ۵۹۰ نانومتر برانگیخته می شود.

مطالب مرتبط: تکنیک الایزا – تکنیک وسترن بلات –تکنیک ایمونوسیتوشیمی – تکنیک ایمونوهیستوشیمی
خدمات مرتبط: انجام تکنیک وسترن بلات و الایزا با بانکی غنی از انواع آنتی بادی – انجام خدمات ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی با بانکی غنی از انواع آنتی بادی