مبانی طراحی پرایمر miRNA

طراحی پرایمر miRNA بسیار حائز اهمیت می باشد چرا که میکرو RNAها می ­توانند به عنوان یک انکوژن و یا سرکوبگر تومور در ایجاد سرطان­ های مختلف ایفای نقش نمایند. بدین ترتیب تغییرات بیان این عوامل ژنتیکی که بسته به نوع هر تومور متفاوت می­ باشد، فرصتی منحصر به فرد را در استفاده از آن­ ها برای تشخیص سرطان فراهم می آورد. به عنوان مثال تحقیقات نشان داده­ اند افزایش میان برنامه mir-9, mir-21 به ترتیب با سرطان معده و سرطان کولون و کاهش میزان بیان mir-34, mir-449a به ترتیب با سرطان ریه و پروستات همراه می ­باشد.

امروزه تحقیقات مختلفی حضور میکرو RNAها را در حالات فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی متعددی از جمله سرطان در پلاسما نشان داده ­اند و مشخص شده که میکرو RNAهایی که در ایجاد و پیشرفت تومور نقش دارند از پایداری قابل ملاحظه­ ای در خون وپلاسما برخوردار می­باشند. بدین ترتیب سهولت دسترسی به نمونه و پایداری حضور آن ها در پلاسما امکان استفاده از این عوامل مولکولی را به عنوان یک بیومارکر غیر تهاجمی فراهم آورده است. از سویی دیگر، مطالعات حاکی از وجود پروفایل اختصاصی بیانی میکرو RNA ها در هر تومور در خون می ­باشد. از این رو با استفاده از این یافته ­ها میتوان تشخیص هر سرطان را با اندازه­گیری میکرو RNA های مخصوص آن تومور در خون با استفاده روش­ های مولکولی انجام داد.

تکنیک  qRT-PCR، روشی مناسب برای تعیین کمیت و میزان بیان ژن­ ها بوده که نتایج آن از صحت و دقت بالاتری نسبت به روش­ های پیشین برخوردار است و به عنوان یکی از متداول­ترین روش­ ها برای اندازه­ گیری میکرو RNA های موجود در پلاسما محسوب می­ گردد. از مهمترین مزیت ­های این تکنیک می توان به حساسیت و کمیت سنجی دقیق آن نسبت به سایر روش­ ها اشاره کرد. در مطالعات آنالیز بیان ژن، نرمال­ سازی نمونه­ های آزمایشی جهت کاهش خطای نمونه برداری بسیار با اهمیت می­ باشد.

روش های طراحی پرایمر miRNA ها

از آنجائیکه طول miRNA های بالغ بسیار کوتاه (حدود ۲۲ نوکلئوتید) می باشد لذا به روش های مرسوم سنتز cDNA که برای نمونه های mRNA استفاده می شود نمی توان برای miRNA ها واکنش سنتز cDNA را انجام داد. بنابراین ابتدا لازم است به روش هایی طول miRNA بالغ افزایش یابد و سپس از روی توالی طویل شده رشته های cDNA سنتز گردد. استراتژی های مختلفی جهت افزایش طول miRNA بالغ مورد نظر وجود دارند  که براساس نوع پرایمرهای طراحی شده بخصوص برای مرحله سنتز cDNA از یکدیگر متمایز می شوند.

روش مبتنی بر پرایمرهای Stem loop

در این روش طراحی پرایمر miRNA با استفاده از یک پرایمر اختصاصی از نوع stem loop رشته cDNA از روی توالی miRNA بالغ صورت می گیرد. پرایمر stem loop الیگونوکلئوتید هایی به طول حدود ۵۰ جفت باز و از جنس DNA هستند که شش نوکلئوتید انتهای ´۳ آن ها به صورت مکمل با شش نوکلئوتید انتهای ´۳ توالی miRNA مورد نظر طراحی می شود. اتصال اختصاصی هر پرایمر stem loop به توالی مکمل خود در miRNA بالغ مورد نظر انتهای ´۳ مورد نیاز برای فعالیت آنزیم نسخه بردار معکوس را در طی واکنش سنتز cDNA فراهم می آورد. این روش به علت تولید اختصاصی cDNA از اختصاصیت بالاتری برخوردار است. چرا که در پایان مرحله سنتز cDNA، تنها توالی cDNA اختصاصی مربوط به miRNA مورد نظر ساخته می شود.

برای انجام واکنش PCR، پرایمر Forward دقیقا مکمل با ۱۲ الی ۱۷ نوکلئوتید ابتدایی از انتهای ´۵ توالی miRNA بالغ طراحی می شود که برای افزایش دمای Tm آن می توان بین ۳ تا ۶ نوکلئوتید G و C به انتهای ´۵ پرایمر طراحی شده اضافه نمود. پرایمر Reverse نیز معمولا مکمل توالی در انتهای ´۵ پرایمر Stem loop طراحی می گردد.

لازم به ذکر است در مورد miRNA ها نیز جهت طراحی پرایمرهای Forward و Reverse تمامی اصول کلی طراحی پرایمر بایستی مدنظر قرار گیرد.

روش مبتنی بر پلی آدنیلاسیون 

در طراحی پرایمر miRNA روش پلی آدنیلاسیون، ابتدا در طی یک واکنش آنزیمی با استفاده از آنزیم پلی A پلیمراز و نوکلئوتیدهای ATP یک تردافی از نوکلئوتید A معروف به دم پلی A در انتهای ´۳ توالی miRNA بالغ ساخته می شود.

جهت سنتز cDNA یک پرایمر حاوی ترادفی از نوکلئوتید های T (الیگوdT) در انتهای ´۳ و ترادفی تصادفی حاوی هر ۴ نوع نوکلئوتید در انتهای ´۵ آن (قطعه آداپتور) طراحی می شود. پرایمر طراحی شده از بخش الیگو dT خود به دم پلی A در توالی miRNA متصل شده و رشته مکمل miRNA را که همان cDNA است می سازد.

برای انجام PCR، پرایمر Forward دقیقا مکمل با ۱۲ الی ۱۷ نوکلئوتید ابتدایی از انتهای ´۵ توالی miRNA بالغ طراحی می شود که برای افزایش دمای Tm آن می توان بین ۳ تا ۶ نوکلئوتید G و C به انتهای ´۵ پرایمر طراحی شده اضافه نمود. پرایمر Reverse نیز معمولا مکمل توالی آداپتور انتهای ´۵ پرایمر الیگو dT مورد استفاده برای مرحله سنتز cDNA طراحی می گردد.

لازم به ذکر است در این روش نیز جهت طراحی پرایمرهای Forward و Reverse تمامی اصول کلی طراحی پرایمر بایستی مدنظر قرار گیرد.

منابع:

Parvaee P, Mondanizadeh M, Khansarinejad B, Emami Razavi AN. To Select the Appropriate Reference Gene for Normalizing the Quantitative Data to Assess MicroRNAs in Plasma Samples of Patients with Gastric Cancer. Journal of Arak University of Medical Sciences. 2016 Aug 10;19(5):12-20.

Rusek AM, Abba M, Eljaszewicz A, Moniuszko M, Niklinski J, Allgayer H. MicroRNA modulators of epigenetic regulation, the tumor microenvironment and the immune system in lung cancer. Molecular cancer. 2015 Dec;14(1):1-0.

Gao L, Zuo H, Liu K, Li H, Zhong G. A new strategy for identification of highly conserved microRNAs in non-model insect, Spodoptera litura. International journal of molecular sciences. 2012 Jan;13(1):612-27. S. Kim, J. Jang, M.-S.

Lee, S.-M. Yoo, Analysis of the expression pattern of microRNA of KSHV in KSHV-infected human cells, Journal of Bacteriology and Virology 43 (2013) 328.

مطالب مرتبط: میکرو RNA ها و سرطان – طراحی پرایمر
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR