طول کوتاه چرخه تولید مثل یا چرخه ی استروس (estrus) در جوندگان، این جانوران را به مدل حیوانی ایده آل برای بررسی تغییراتی که در طول چرخه تولید مثل رخ می دهد تبدیل می کند. تعیین سیکل باروری موش و رت در بسیاری از مطالعات حیوانی، بافت شناسی، سلولی، میکروبیولوژی و جنین شناسی از اهمیت بسزایی برخوردار است. در موش آزمایشگاهی و رت، شناسایی مرحله چرخه فحلی بر اساس نسبت انواع سلول های مشاهده شده در ترشحات واژن انجام می گیرد.
مطالب پیشنهادی: مدل حیوانی هایپراستیمولیشن تخمدان OHSS – انواع مدل های نقص جنینی
تعیین سیکل باروری موش و رت
چرخه ی استروس در موش آزمایشگاهی ماده معمولاً ۵-۴ روز طول می کشد و به چهار مرحله ی پرو استروس، استروس، متستروس و دی استروس تقسیم می شود: موش های ماده تنها زمانی می توانند باردار شوند که تخمک گذاری اتفاق بیفتد (در طول مرحله استروس). این مرحله فقط حدود ۱۵ ساعت طول می کشد و تخمک گذاری معمولا در اواسط چرخه تاریکی اتفاق می افتد.
در مطالعات حیوانی مربوط به تولید مثل و تأثیر چرخه فحلی بر باروری، از سیتولوژی اسمیر واژینال برای تعیین مراحل چرخه فحلی استفاده می شود. در این روش می توان چرخه ی استروس را با توجه به نسبت سه نوع سلول مشاهده شده در اسمیر واژن یعنی سلول های اپی تلیال هسته دار، سلول های اپی تلیال شاخی شده و لکوسیت ها پیش بینی کرد. بنابراین ارائه پروتکل هایی برای جمع آوری سریع و دقیق اسمیر واژینال و تعیین مراحل چرخه فحلی در موش های آزمایشگاهی از اهمیت بالایی برخوردار است.
مرحله پرواستروس (Proestrus) در چرخه فحلی
در این مرحله سلول های اپیتلیالی دارای هسته هستند و ممکن است به صورت خوشه ای یا تک دیده شوند. گاهی اوقات نیز ممکن است برخی از سلول های شاخی در نمونه ظاهر شوند. این مرحله مربوط به روز قبل از تخمک گذاری است، زمانی که E2 افزایش می یابد و در نتیجه در طول شب، افزایش LH و FSH و تخمک گذاری اتفاق می افتد.
مرحله استروس (Estrus)
این مرحله به طور مشخص با سلول های اپیتلیال سنگفرشی شاخدار مشخص می شود که به صورت خوشه ای دیده می شوند. هیچ هسته قابل مشاهده ای وجود ندارد. سیتوپلاسم سلول ها دانه ای و با شکل نامنظم است. E2 در طول صبح بالا باقی می ماند و در بعد از ظهر به سطح پایه کاهش می یابد.
مرحله متستروس (Metestrus) در چرخه فحلی
در این مرحله، ترکیبی از انواع سلول ها با غلبه لکوسیت ها و چند سلول اپیتلیال هسته دار و سلول های اپیتلیال سنگفرشی شاخدار وجود دارد. غلظت E2 پلاسما کم است.
مرحله دیستروس ( Diestrus ) در چرخه فحلی
این مرحله عمدتاً از لکوسیت ها تشکیل شده است. در این مرحله سطوح E2 شروع به افزایش می کند.
مراحل چرخه ی استروس شامل پرواستروس (A)، استروس (B)، متستروس (C)، دی استروس (D) است.
در طول چرخه فحلی، متستروس و دی استروس، مقدار FSH و LH در گردش پلاسمایی کم است.
در مواردی که حیوانات ممکن است استرس اولیه ناشی از جا به جایی از خود نشان دهند، تشخیص مراحل چرخه فحلی در سه روز اول تجزیه و تحلیل دشوار می باشد. پس از این دوره، حیوانات به دست ورزی عادت کرده و در نتیجه جمع آوری ترشحات آسان می شود.
ارزیابی باز شدن واژن در موش و رت
باز شدن واژن به عنوان شاخص خارجی شروع بلوغ در نظر گرفته می شود که در نتیجه افزایش ترشح استرادیول رخ می دهد و می توان با تزریق استرادیول به موش ها یا رت های آزمایشگاهی نابالغ باز شدن واژن را تسریع کرد. در حالی که باز شدن واژن در رت همزمان با اولین تخمک گذاری اتفاق می افتد، باز شدن واژن در موش ممکن است تا ۱۰ روز قبل از شروع چرخه فحلی رخ دهد.
سن باز شدن واژن در موش های آزمایشگاهی با پایش هر روز صبح از ۲۴ روزگی تا ۳۰ روزگی ثبت می شود. معمولاً باز شدگی واژن از طریق یک معاینه بصری ساده انجام می شود. در موش ها، باز شدن واژن در حدود ۲۶ روزگی اتفاق می افتد.
رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی برای به حداقل رساندن استرس موش آزمایشگاهی و در عین حال محافظت از فرد در برابر آسیب هایی مانند گاز گرفتن ضروری است. موش را با دست غالب از پایه دم بلند کنید. سپس، از دست مخالف برای گرفتن پوست شل در ناحیه پشت گردن (با انگشتان شست و اشاره) استفاده کنید. حیوان را بلند کرده و با یک دست مهار کنید. از دست دیگر برای بررسی واژن استفاده کنید و ببینید که آیا واژن کاملاً باز است یا خیر. مهم است که اطمینان حاصل شود که هیچ ترشحی در محل واژن نباشد. به همین دلیل واژن را با یک تکه پنبه مرطوب شده با محلول سالین تمیز کنید.
(A) پرو استروس (B) استروس (C) متستروس (D) دی استروس
مطالب پیشنهادی: اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی نظیر موش، رت، خرگوش – القا مدل حیوانی آزواسپرمی
جمع آوری و تجزیه و تحلیل ترشحات واژن
در این بخش روشی سریع برای به دست آوردن نمونه برای تجزیه و تحلیل مرحله چرخه فحلی در جوندگان را توصیف می کنیم. از آنجایی که برخی از مراحل چرخه فحلی بسیار کوتاه هستند (مثلاً متستروس)، جمع آوری نمونه در زمان مشخص به صورت روزانه ضروری است.
موش آزمایشگاهی را مطابق توضیحات ذکر شده مهار کنید. نوک پیپت پلاستیکی را که با PBS یا سالین (حدود ۱۰ میکرولیتر) پر شده است، داخل واژن قرار دهید. واژن را به آرامی سه تا پنج بار با همان محلول شستشو دهید. بعد از شستشوی آخر محلول را با نوک پیپت جمع کنید. حجم ۱۰ میکرولیتر محلول سالین امکان جمع آوری ترشحات کافی برای بررسی سیتولوژی واژن را فراهم می کند.
نمونه گرفته شده از مایع واژن را روی یک لام قرار دهید، برای تهیه ی لام از نمونه احتیاجی به لامل نیست. لام را زیر میکروسکوپ نوری قرار داده و با عدسی ۱۰× مشاهده کنید. اگر نمونه خشک شود، می توانید سالین بیشتری (کمتر از ۱۰ میکرولیتر) به نمونه اضافه کنید. برای مشاهده ی سلول ها و کنتراست خوب از نور کم میکروسکوپ استفاده کنید.
با استفاده از عدسی ۴۰× ، شناسایی انواع سلول‌ها آسان‌تر از استفاده از عدسی ۱۰× است. با این حال، تعیین فاز چرخه فحلی بر اساس نسبت بین سه نوع سلول است که در صورت استفاده از عدسی ۱۰× ، تشخیص آن آسان تر است.
در ابتدا ممکن است حیوانات رفتار تهاجمی داشته باشند بنابراین هندلینگ صحیح و ایمن حیوانات در این مرحله ضروری است. در غیر این صورت ممکن است حیوان، فرد را گاز بگیرد. ادرار و مدفوع پاسخ های رایج به استرس هستند. تمیز کردن اطراف واژن و جلوگیری از آلوده شدن ترشحات واژن جمع آوری شده در پیپت از اهمیت بالایی برخوردار است. چنین آلودگی هایی، تجزیه و تحلیل های بعدی را دشوارتر می کند.
سیکل باروری در انسان
در انسان، چرخه تولید مثلی که سیکل قاعدگی نامیده می شود، تقریباً ۲۸ روز طول می کشد، در جوندگان به آن چرخه فحلی می گویند، تقریباً ۵-۴ روز طول می کشد. موفقیت تولید مثل در همه پستانداران به عملکرد محور هیپوتالاموس، هیپوفیز و غدد جنسی بستگی دارد. در زنان، نورون های آزاد کننده ی هورمون گنادوتروپین (GnRH) در ناحیه سپتوم (لوب قدامی مغز) قرار دارد. GnRH آزاد شده در هیپوتالاموس به هیپوفیز قدامی می رسد، و با تحریک سلول های گنادوتروف منجر به ترشح هورمون LH و هورمون محرک فولیکول (FSH) می شوند. در گردش خون محیطی، این هورمون ها سلول های خاصی را در تخمدان تحریک می کنند که منجر به تخمک گذاری می شود. فولیکول های تخمدان استروژن (E2) ترشح می کنند که به هیپوتالاموس می رسد. بیشتر اوقات، غلظت پلاسمایی E2 پایین است. با این حال، در طول دوره قبل از تخمک گذاری، ترشح E2 به اوج خود می رسد و نورون های GnRH تحریک می شوند. به نظر می رسد E2 نورون های GnRH را به طور غیرمستقیم تنظیم می کند.
مطالب مرتبط: پانسمان حیوانات آزمایشگاهی – اتاق حیوانات آزمایشگاهی – خونگیری از حیوانات آزمایشگاهی
خدمات مرتبط: پژوهش و مطالعه بروی حیوانات آزمایشگاهی – ایجاد انواع مدل های حیوانی
