بافت چربی به دلیل داشتن مقادیر زیاد سلول بنیادی در مقایسه با مغز استخوان و قابلیت پیوند به میزبان خودی و غیرخودی توجه زیادی را به خود جلب کرده است. مطالعات جدید نشان می دهد که استفاده از بافت چربی به عنوان منبعی برای جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی، پتانسیل عظیمی برای کاربردهای مهندسی بافت و تهیه داربست طبیعی فراهم کرده است.
برای اطلاع از لیست آنتی بادی های تائید ماهیت سلول های مزانشیمی نظیر CD73,CD105,CD90 و… اینجا کلیک کنید
نحوه جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت چربی
برای جداسازی سلول های مزانشیمی ml 30-20 نمونه بافت چربی از نواحی شکم و پهلو توسط پزشک جراح، در اتاق عمل و تحت شرایط استریل برداشت می شود. نمونه چربی داخل کیسه استریل حاوی محیط کشت سلولی(DMEM) Dulbecco’s Modified Eagle Medium دارای آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین در حداقل زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل می گردد.
جداسازی مکانیکی بافت چربی
برای جداسازی سلول های مزانشیمی، ابتدا می بایست نمونه بافت چربی در اتاق کشت و زیر هود لامینار توسط قیچی و تیغ جراحی استریل به قطعات ریز تبدیل شود. طی جداسازی سلول، تا حد امکان عروق خونی و بافت همبند از بافت چربی زرد رنگ حذف می گردد. به منظور حذف سلول های خونی و سایر ذرات دیگر، طی روند جداسازی سلول، نمونه چربی چندین بار توسط محلول (PBS) Phosphate-Buffered Saline شستشو داده شده و محلول رویی دور ریخته می شود.
مطالب مرتبط: روش جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت جفت – سلول های بنیادی مزانشیمی
تیمار بافت چربی به وسیله آنزیم
بافت چربی سفید باقی مانده در کف پلیت جداسازی سلول به لوله فالکون منتقل و ml 6-5 آنزیم کلاژناز نوع سه ۰/۱% به آن اضافه و با استفاده از سرنگ پیپتاژ می گردد تا در حد امکان بافت هموژن شده و جداسازی سلول از بافت امکان پذیر شود. سپس تمام محتویات به یک لوله فالکون ۵۰ میلی لیتری منتقل و برای بهبود جداسازی سلولی در انکوباتور با دمای ۳۷°C ، به مدت ۳ -۱/۵ ساعت قرار می گیرد. در طول این مدت با تکان دادن لوله حاوی نمونه جداسازی سلول، به تجزیه بیش تر بافت چربی کمک می شود.
بعد از مرحله تجزیه آنزیمی لوله های حاوی نمونه جداسازی سلول از انکوباتور بیرون آورده شده و با rpm 2000 به مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ می شوند. این عمل حدود سه بار تکرار می شود. باید توجه داشت برای جداسازی سلول هایی با کیفیت بالاتر می باید، روغن و بافت چربی رویی به آرامی برداشته و دور ریخته شود.
کشت سلول های بنیادی در فلاسک کشت T75
محلول انتهایی لوله که حاوی سلول های چربی است به فلاسک کشت T75 حاوی DMEM همراه با FBS 10% منتقل می شود. سپس آنتی بیوتیک پنی سیلین – استرپتومایسین با نسبت ۱ به ۱۰۰ از پلاک سلولی به سلول ها اضافه می شود. در نهایت فلاسک حاوی سلول ها داخل انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد و CO2 با غلظت ۵ درصد قرار داده می شود.
تعویض محیط کشت و پاساژ سلولی
بعد از جداسازی سلول های مزانشیمی هر چهار روز یک بار تعویض محیط انجام می گردد. بدین منظور محلول رویی فلاسک دور ریخته شده و سپس محیط کشت تازه DMEM همراه با FBS 10%، به فلاسک کشت جداسازی سلول اضافه و مجدد به داخل انکوباتور منتقل می شود. در این مرحله رشد و چسبندگی سلول ها زیر میکروسکوپ نوری معکوس ارزیابی و تعداد سلول ها با لام نئوبار شمارش می شود. سلول ها در این مرحله حالت کروی دارند.
بعد از این که با تعویض منظم محیط کشت، سلول ها به تراکم Confluence رسیدند برای انتقال سلول ها به فلاسکی بزرگ تر، پاساژ سلولی انجام می شود. بعد از سه بار پاساژ سلولی، به منظور تائید ماهیت مزانشیمی سلول های بنیادی کشت شده و جداسازی سلولی از تکنیک فلوسایتومتری استفاده می شود. سلول های مزانشیمی در in vitro فنوتیپ پایداری دارند و به صورت تک لایه باقی می مانند و قادر به تمایز به استخوان غضروف بافت چربی، تاندون، عضله و بافت فیبری هستند.
جداسازی سلول مزانشیمی از بافت چربی بدون استفاده از آنزیم
برای جداسازی سلول مزانشیمی از بافت چربی می توان بدون استفاده از آنزیم نیز این فرایند را پیش برد. در این روش جداسازی، بافت چربی از ناحیه کشاله ران با رعایت شرایط استریل جدا و بعد از شستشو به محلول ایزوتونیک منتقل می گردد. سپس با استفاده از قیچی و تیغ جراحی جداسازی مکانیکی انجام و بافت چربی به قطعاتی با اندازه تقریبی ۱ تا ۲ میلیمتر مکعب، تبدیل می شوند جهت بهبود جداسازی سلولی و زدودن سلول های خونی و قطعات بافت های دیگر، چندین مرتبه توسط PBS سرد شستشو داده می شود.
قطعات بافت چربی بدون دخالت آنزیم و هیچ هضم آنزیمی با استفاده از پنس به فلاسک کشت انتقال داده می شوند و به ظرف کشت، محیط کشت DMEM حاوی ۱۰درصد FBS و یک درصد آنتی بیوتیک (پنیسیلین_استرپتومایسین) افزوده می شود. برای جداسازی سلول ها می بایست در شرایط دمایی ۳۷ درجه سانتی گراد و ۵ درصد دی اکسید کربن، کشت داده شوند و محیط کشت سلول ها با فواصل زمانی ۲ روز تعویض گردند. بعد از ۲۴ ساعت از فرایند جداسازی سلول، کشت ریز قطعه های بافت چربی قابل مشاهده هستند. جداسازی سلول های مزانشیمی به وسیله دوربین عکسبرداری متصل به میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرارمی گیرد.
برای اطلاع از لیست آنتی بادی های تائید ماهیت سلول های مزانشیمی نظیر CD73,CD105,CD90 و… اینجا کلیک کنید
مطالب مرتبط: روش جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت جفت – آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی
خدمات مرتبط:خدمات سلولی – محیط های کشت تمایزی – انجام خدمت فلوسایتومتری با بانکی غنی از انواع آنتی بادی
