اجزا و نواحی تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمیدهای بیانی Promoter & Replicon Region

1. Replicon
2. Promoter
3. Ribosome Binding Site
4. Selection Marker
5. Multiple Cloning Site

 

Replicon Region

که شامل یک ناحیه آغازگر همانندسازی بنام Ori و عناصر تنظیمی Cis-acting می باشد. عناصر ژنتیکی که می توانند بصورت خود به خودی هماندسازی کنند، مثل پلاسمید، دارای Replicon  می باشند. از جمله پارامتر مهمی که هنگام انتخاب وکتور مناسب باید درنظر گرفت، تعداد کپی آن ها می باشد. کنترل تعداد کپی پلاسمید به ناحیه Ori آن بستگی دارد.

پلاسمیدها براساس ناحیه Ori شان به گروه های زیر دسته بندی می شوند:

۱. Low Copy Number

(for 15-20 copy per cell – e.g. pBR22)

۲. High Copy Number

(for 500-700 copy per cell) (e.g. pUC18)

بطور معمول برای بیان پروتئین و کلون کردن، از پلاسمیدهای با تعداد کپی بالا استفاده می شود. در بعضی موارد یک کپی بالا ممکن است برای کلونینگ DNA مشکل ایجاد کند. برای مثال، DNA کلون شده ممکن است پروتئین‌هایی را کد کند که در مقادیر بالا برای سلول توکسیک باشند. حتی اگر پروتئینی از DNA کلون شده در سطح پائینی بیان شود، وجود کپی‌های زیاد از ژن داخل پلاسمید ممکن است سطح پروتئین را تا حد سمیت بالا ببرد. در این موارد استفاده از پلاسمیدهایی با تعداد کپی پایین تر می‌تواند سطح پروتئین را تا زیر حد سمیت کاهش دهد.

همچنین باید این نکته را در نظر داشت که بدلیل محدودیت متابولیکی، داشتن تعداد کپی بالا، سبب کاهش رشد باکتری می شود و ممکن است باعث ناپایداری پلاسمیدی هم بشود و بنابراین تعداد ارگانیسم های سالمی که پروتئین تولید می کنند کاهش می یابد. به همین دلیل استفاده از پلاسمیدهای با تعداد کپی بالا، دلیل بر افزایش تولید پروتئین نمی شود.

در صورت نیاز به استفاده از ۲ پلاسمید، از پلاسمیدهایی استفاده می شود که ناحیه آغازگر آنها باهم سازگار باشند. بعبارت دیگر، پلاسمیدهای یک گروه نباید بطور همزمان وارد میزبان شوند.

در جدول زیر تعدادی از رایجترین پلاسمیدهای مورد استفاده در کلونینگ و نوع ناحیه Ori آنها ذکر شده است.

Promoter Region

پروموتور سبب بیان پروتئین می شود و شامل پروموتور ( جایگاه اتصال RNA پلی مراز) و اپراتور می باشد. توالی ژنی پروموتور، اتصال RNA پلی مراز و فاکتورهای رونویسی را کنترل می کند. پروموتور موجود در پلاسمید باید با نوع RNA یی که قرار است سنتز شود سازگاری داشته باشد. به عنوان مثال :

برای سنتز mRNA  از   پروموتورRNA Polymerase II و برای سنتز shRNA  از پروموتورRNA Polymerase III  استفاده می شود.

همچنین پروموتوری که انتخاب می کنید باید با سلول میزبان سازگاری داشته باشد، زیرا سیستم رونویسی در سلول ها و ارگانیسم های مختلف، متفاوت می باشد و پروموتور از سیستم رونویسی میزبان استفاده می کند.

برخی از رایجترین پروموتورهای باکتریایی مورد استفاده در کلونینگ

مطالب مرتبط: نواحی تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمید Selection Marker Ribosome Binding Site – فرآیند بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب در سیستم بیانی پروکاریوتی