ژنتیک

انواع مواد و تجهیزات مورد نیاز در تکنیک وسترن بلات

بافر و کاغذ وسترن

 

اساس کار جداسازی پروتئین‌ها در western blotting اندازه پروتئین‌هاست.هنگامی که پروتئین‌ها در حضور SDS و عوامل دناتوره کننده قرار می‌گیرند به طور کامل از یکدیگر جدا می‌شوند.

نکته : آکریل آمید یک نوروتوکسین انباشته شده‌ی قوی است. همواره در هنگام کار با آن دستکش بپوشید.

بافر نمونه (Loading Buffer)

 

🔹برای لود نمونه‌ها در ژل الکترفورز ما از Loading Buffer استفاده می‌کنیم.
🔹برموفنل بلو موجود در Loading Buffer دارای بار منفی است که به حرکت نمونه‌ها در ژل از کاتد به آند (براساس تنها، اندازه‌ی پروتئین‌ها) کمک می‌کند.
🔹این بافر، به دلیل داشتن رنگ آبی، نشانگر حرکت نمونه‌ها در ژل است.
🔹مقدار Loading Buffer که برای هر نمونه استفاده می‌شود، متناسب با نمونه‌ای است که بیشترین غلظت پروتئین را دارد.
🔹نسبت Loading Buffer به نمونه‌ها معمولا ۱ به ۱ است، چون ممکن است نمونه‌های ما حجم کل چاهک را پر نکند و نمونه‌ها با حجم‌های متفاوت در ژل شروع به حرکت کنند( این امر موجب بالا و پایین شدن نمونه‌ها در ژل می‌شود) بنابراین حجم تمام نمونه‌ها را با استفاده از آب مقطر باید به میزان یکسان رساند.

کاغذ (pvdf) یا (polyvinylidene difluoride) و نیتروسلولز (Nitrocellulose)

🔹هر دو کاغذ pvdf و نیتروسلولز برای وسترن بلات و آنالیز آمینو اسیدها مورد استفاده قرار می‌گیرد. به طور کلی کاغذ pvdf دارای ظرفیت اتصال پروتئین‌هایی با وزن مولکولی بالاتر است و دارای حساسیت بیشتر نسبت به کاغذ نیتروسلولز است. این ویژگی کاغذ pvdf اجازه شناسایی پروتئین‌هایی با بیان کمتر را به ما می‌دهد.

🔹در هنگام استفاده از این کاغذ احتمال وجود نویزهایی در مرحله تشخیص آنتی بادی شما وجود دارد. از سوی دیگر ممکن است کاغذ نیتروسلولز حساسیت تشخیص کاغذهای pvdf را نداشته باشد اما در هنگام آشکارسازی باندها نویزهای کمتری ایجاد می‌کند. همچنین به طور معمول از کاغذ نیتروسلولز برای شناسایی پروتئین‌ها با وزن مولکولی کمتر استفاده می‌شود.

 

نکات مهم :

🔹محلول بلاکینگ بافر مورد استفاده برای وسترن می‌تواند یا از پودر (BSA) یا (Bovine Serum Albumin) و یا از Skim milk تهیه شود.

🔹زمان انکوبه شدن کاغذ در محلول بلاکینگ بافر یا دو ساعت در دمای اتاق است و یا به صورت Overnight در دمای چهار درجه می‌باشد.

🔹زمان انکوبه شدن کاغذ در آنتی بادی اولیه‌، دو ساعت در دمای اتاق است و یا بصورت Overnight در دمای ۴ درجه می‌باشد.(البته باید به این نکته توجه داشت که برخی از آنتی بادی ها در دمای اتاق به سرعت فاسد می شوند بنابراین باید آنها را به صورت overnight و در دمای ۴ درجه مورد استفاده قرار داد).

🔹آنتی بادی ثانویه مورد استفاده برای وسترن بلات باید با HRP و یا AP کنژوکه شده باشد .

برچسب ها
نمایش بیشتر
دکمه بازگشت به بالا
بستن