با وجود اینکه تکنیک وسترن بلاتینگ، یک روش نسبتا ساده است ولی ممکن است در حین انجام کار، مشکلاتی به وجود بیاید که منجر به ایجاد نتایج غیر منتظره گردد از جمله:
- باندهای غیرمعمول و غیر منتظره
- عدم وجود باند
- باندها یا سیگنال‌های ضعیف
- ایجاد پس زمینه زیاد روی کاغذ
- ایجاد نقاط ناهموار و ناجور روی کاغذ
باندهای غیر معمول
- این باندها می‌تواند به دلیل آسیب پروتئاز ایجاد شوند که منجر به ایجاد باندهایی در موقعیت‌های غیر منتظره می‌کند.
- برای رفع این مشکل بهتر است از یک نمونه تازه که روی یخ نگهداری می‌شود استفاده کرد و یا اینکه آنتی‌بادی را تغییر داد. اگر باندهای پروتئین بالاتر از سطح مورد نظر دیده شود، گرم کردن نمونه می‌تواند به شکستن ساختار چهار گانه پروتئین کمک کند.
- باندهای محو، اغلب به دلیل ولتاژ بالا و یا حباب هوای موجود در جریان برق ایجاد می‌شود. در این مورد باید اطمینان حاصل شود که ژل در ولتاژ پایین اجرا شده و ساندویچ وسترن به درستی آماده شده است.
- تغییر رانینگ بافر نیز می‌تواند به رفع این مشکل کمک کند.
عدم تشکیل باند
- عدم تشکیل باند می‌تواند به دلایل متعددی که مربوط به آنتی‌بادی، آنتی‌ژن یا بافر مورد استفاده است، باشد.
- اگر آنتی بادی مورد استفاده نامناسب باشد(چه اولیه – چه ثانویه)، هیچ باندی نشان داده نخواهد شد، علاوه بر این غلظت آنتی‌بادی نیز باید مناسب باشد.
- اگر خیلی کم باشد ممکن است سیگنالی مشاهده نشود. باید به خاطر داشته باشیم که بعضی از آنتی‌بادی‌ها برای وسترن قابل استفاده نیستند.
- دلیل دیگر می‌تواند غلظت کم و یا عدم وجود آنتی‌ژن باشد، در این مورد می‌تواند از یک منبع دیگر برای تایید مشکل نمونه یا سایر عناصر مثل آنتی‌بادی استفاده کرد.
- شستشوی طولانی مدت نیز می‌تواند سیگنال را کاهش دهد. همچنین بافرها می‌توانند به ایجاد این مشکل کمک کنند.
- باید دقت داشت که بافرهایی مانند ترانسفر بافر، TBSو رانینگ بافر همه تازه و بدون آلودگی باشند. اگر بافرها با آیزید سدیم آلوده شوند می‌توانند HRP را غیر فعال کنند.
- دلیل دیگر می‌تواند استفاده از شیرخشک بدون چربی باشد که می‌تواند آنتی ژن را بپوشاند. در این مورد می‌توان از BSA به عنوان بلاکینگ بافر استفاده کرد و یا میزان استفاده از شیر را کاهش داد.
