ژنتیک

وسترن بلات ( Western Blot) چیست ؟

آموزش قدم به قدم مراحل وسترن بلات

وسترن بلات (پروتئین بلاتینگ یا ایمنو بلاتینگ) یک روش بسیار قدرتمند و مهم برای شناسایی پروتئین ها است. وسترن بلاتینگ را به نام های دیگری از جمله ایمنوبلات (immunoblot) یا پروتئین بلاتینگ ( Protein Blotting ) نیز می شناسند. از وسترن بلات اغلب در تحقیقات پزشکی برای جداسازی و شناسایی پروتئین ها استفاده می شود که با استفاده از این روش، شناسایی اختصاصی پروتئین هدف با آنتی‌بادی اختصاصی صورت می گیرد.

آموزش قدم به قدم تکنیک وسترن بلات

ویدیو آموزش مرحله به مرحله وسترن بلات

برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

برای اطلاع از هزینه تکنیک وسترن بلات کلیک کنید

تاریخچه استفاده از تکنیک وسترن بلات

در اواخر دهه ۱۹۷۰، در ابتدا Towbin و همکاران پروتئین ها را بوسیله ژل پلی آکریل آمید جدا کرده و به غشای نیتروسلولز انتقال دادند. بعد از آن Burnette، در روش جداسازی از ژل پلی آکریل آمید از آن استفاده کرد که منجر به روش وسترن بلات گردید.

وسترن بلات از تکنیک ساترن بلات  ( Southern blotting ) که جهت تشخیص و شناسایی قطعات DNA جدا شده بوسیله ژل الکتروفورز مورد استفاده قرار می­گیرد، تکامل یافته است. وسترن بلات، همچنان در تحقیقات و طرح های پژوهشی روز دنیا به عنوان ابزاری کاربردی و دقیق، جهت شناسایی پروتئین ها مورد استفاده قرار می گیرد. از این رو استقبال گسترده‌­ای از آموزش وسترن بلات از سوی دانشجویان علوم پزشکی و سایر محققان بیولوژی به عمل آمده است.

تاریخچه استفاده از تکنیک وسترن بلات و ساترن بلات

دلایل و کاربرد استفاده از تکنیک وسترن بلات

یکی از تکنیک‌­هایی که در مسیر تحقیق و توسعه تولید داروهای پزشکی و تشخیص و درمان به پژوهشگران و بیولوژیست ها کمک زیادی کرده است، تکنیک وسترن بلات (Western blot) می­باشد.

  شناسایی و اندازه گیری بیـان پروتئیـن در بافتهـا در تمام آزمایشـگاه های تحقیقاتی سلولی مولکولی، علوم و اعصاب، ژنتیکی، بیوشیمیایی و سایر مراکز تخقیقاتی و دانشگاه ها ضـروری اسـت. وسترن بلات نتایـج کیفـی قابل قبولی بـرای تعییـن محتـوای پروتئیـن هـدف در نمونه های سلولی و بافتی به محقق نشان می دهد که در نهایت با کمی کردن این نتایج کیفی، تـشخیص بیـان پروتئیـن را به طور دقیق بر ما آشکار می کند.

 دلایلی زیادی از جمله تشخیص بیماری­ها در نمونه­‌های بیولوژیکی، شناسایی پروتئین‌­های آلرژی­‌زا در نمونه های غذایی و غیره وجود دارد که دانشجویان علوم پایه پزشکی، به خصوص محققین بیولوژی، نیاز به شناسایی و تعیین اندازه یک یا چند پروتئین از بین ترکیبی از پروتئین های استخراج شده از نمونه، با استفاده از یک تست آزمایشگاهی با اهمیت و با کارآیی بالا دارند.

موارد مهم و قابل تأمل در انجام  آزمایش وسترن بلات

  • یکی از نکات مهم در انجام تکنیک وسترن بلات، خطایابی و حل مشکلات به وجود آمده جهت رسیدن به نتیجه درست میباشد. در صورتی که شما در حین انجام این آزمایش با مشکل مواجه شدید میتوانید به صفحه راهنمای تخصصی عیب یابی تکنیک وسترن بلات مراجعه کنید .
  • دومین مورد پر اهمیت در انجام تکنیک وسترن بلات میتوان به مواد مورد نیاز و تجهیزات لازم وسترن بلات اشاره کرد.
  • مورد بعد که از اهمیت بالایی برخوردار است، انجام دقیق و گام به گام مراحل وسترن بلات توسط کارشناس آزمایشگاه یا دانشجویان می باشد که در این مقاله به طور کامل به یادگیری آن می پردازیم.

مراحل تست وسترن بلات ( پروتکل اجرایی وسترن بلات )

     وسترن بلات تکنیکی بر پایه آنتی­‌بادی است که به جهت جداسازی پروتئین مجهول، تعیین اندازه و نوع پروتئین در نمونه بیولوژیکی مورد استفاده قرار می­گیرد. این تکنیک بطور کلی شامل سه مرحله اساسی است :

  • جداسازی پروتئین ها بر اساس اندازه
  • انتقال به غشاء جامد
  • نشاندار کردن پروتئین هدف با آنتی بادی اولیه و ثانویه مناسب جهت تشخیص

      بطور خلاصه، در تکنیک وسترن بلات، پروتئین­‌ها در نمونه های محلول، به وسیله ژل الکتروفورز جدا و به دنبال انتقال آن­ها به غشا، با آنتی­‌بادی­‌های اختصاصی هدف نشاندار می­شوند. نهایتا با شناسایی آنتی­‌ژن سطحی پروتئین هدف توسط آنتی‌­بادی اختصاصی، بیان یا عدم بیان پروتئین، اندازه و مقدار پروتئین­ مجهول تشخیص داده می­شود.

 مراحل استخراج پروتئین در تکنیک وسترن بلات
مراحل استخراج پروتئین در تکنیک وسترن بلات

مرحله اول : استخراج پروتئین در نمونه های سلولی و بافتی

    قبل از شروع پروتکل وسترن بلات، گام اساسی آماده سازی نمونه است. تیمار مناسب و پروتکل صحیح استخراج پروتئین از انواع مختلف نمونه ­ها مانند خون، سلول و بافت، می­تواند در نتایج نهایی وسترن بلات موثر باشد.  

  • استخراج پروتئین از نمونه های سلولی

   اگر نمونه مورد نظر، سلول کشت داده شده در آزمایشگاه و از نوع سلول­های چسبنده باشد، سلول پس از شست و شو با بافر PBS، با تریپسین به صورت معلق در می آید. سلولها را به مدت ۵ دقیقه و با دور ۱۵۰۰ RPM سانتریفیوژ و مایع رویی را دور می ریزیم. سپس پلت رسوب داده شده را با بافر لیزکننده و  یا بافر مهارکننده پروتئاز تیمار می کنیم تا برای رعایت درست زنجیره سرمایی، آن را در دمای منفی بیست درجه سانتی گراد نگهداری کنیم.

  • استخراج پروتئین از نمونه های بافتی

     ابتدا بافت های تازه یا منجمد را هموژنایز کرده و سپس با استفاده از بافر لیزکننده و مهارکننده پروتئاز نمونه بافتی لیز می­شود و در نهایت محلول لیز شده را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی (مخلوط پروتئین) را به یک لوله استریل انتقال داده و محتویات استخراج شده را تا انجام بقیه مراحل، روی یخ یا در دمای ۲۰- درجه سانتی­‌گراد نگهداری کنیم که از دناتوراسیون یا تخریب پروتئین­ها جلوگیری شود.

مرحله دوم : تعیین غلظت پروتئین­های موجود در نمونه

      بعد از استخراج، غلظت پروتئین برای وسترن بلات در طول موج ۲۸۰ نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر انجام می­شود. این روش در صورتی کارآمد است که مواد جذب کننده دیگر در محلول حاوی پروتئین نباشد. در غیر این صورت، باید از روش برادفورد یا تکنیک لوری استفاده گردد. اگر غلظت پروتئین استخراج شده به اندازه کافی نباشد، بهتر است پروسه استخراج تکرار شود.

برای آموزش کامل تعیین غلظت در اینجا کلیک کنید

مرحله سوم : آماده سازی ژل، نمونه ها و انجام الکتروفورز

       مرحله بعدی، جداسازی پروتئین­ها بر اساس وزن مولکولی یا بار الکتریکی­ ماکرو‌مولکول است. که به کمک دستگاه الکتروفورز به نام SDS-PAGE انجام می­شود. لازم به ذکر است که روش جداسازی به هدف نهایی از آنالیز نیز بستگی دارد. مثلاً جهت تهیه یک عکس شفاف با رزولوشن بالا از یک پروتئین در محلول آبی، ابتدا باید نمونه­‌ها پس از سانتریفیوژ کامل، بخش شفاف محلول در ژل الکتروفورز لود شود.

بارگذاری نمونه ها در ژل در تکنیک وسترن بلات
بارگزاری نمونه ها در ژل

 ژل مورد استفاده از دو بخش separation gel  برای موقعیت ران نمونه پروتئینی و  stacking gel به عنوان محل قرارگیری چاهک ها تشکیل شده است. غلظت ژل به اندازه پروتئین هدف بستگی دارد مثلا برای پروتئین های با وزن مولکولی کمتر از ۲۰ کیلودالتون، ۲۰% و برای نمونه‌­های بزرگتر از ۲۰۰ کیلودالتون، ۷.۵% است. پس از آماده سازی ژل، ladder و نمونه‌­ها به همراه loading buffer به مدت ۵ دقیقه در ۱۰۰ درجه سانتی­گراد حرارت داده می شود و سپس در چاهک­های ژل تزریق می­شوند. نسبت loading buffer به نمونه پروتئینی، ۱ به ۱ می­باشد. اگر حجم نمونه خیلی کم باشد از آب دیونیزه برای افزایش حجم استفاده می شود. نهایتاً پروتئین­‌ها روی ژل SDS-PAGE به علت بار منفی برموفنل بلو موجود در لودینگ بافر از کاتد به آند حرکت کرده و تفکیک می­شوند. حرکت پروتئین‌­ها در ژل به علت رنگ آبی بافر لودینگ نیز قابل مشاهده است. ضخامت باندهای ایجاد شده به مقدار پروتئین بستگی دارد. هرچه مقدار پروتئین هدف بیشتر باشد ضخامت باند ایجاد شده، چنانچه حین کار خطایی رخ نداده باشد، بیشتر می باشد.

یادآوری : برموفنل بلو یک نوع شناساگر رنگی ست با محدوده PH  بین ۳ تا ۴.۶ که در انجام آزمایشاتی مانند الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید مورد استفاده قرار می گیرد. برمو فنل بلو به جهت بار منفی در ژل به سمت DNA یا پروتئین حرکت می کند که سرعت این جا به جایی به چگالی ژل بستگی دارد.

مرحله چهارم : انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشاء در تکنیک وسترن بلات

ارزش قدرت تفکیک بالای ژل الکتروفورز تنها پس از ظهور وسترن بلات به کامل ترین پتانسیل خود رسید. انتقال موثر پروتئین ها از ژل به غشاء جامد بستگی زیادی به ماهیت ژل، جرم مولکولی پروتئین های منتقل شده و غشای مورد استفاده دارد. وسترن بلات انتقال پروتئین از ژل SDS-PAGE به غشا را امکان پذیر می کند.
بعد از تفکیک نمونه پروتئینی، پروتئین‌ها باید از ژل آکریل‌آمید به غشای مناسب انتقال داده شود تا ردیابی آنتی‌بادی آسان گردد. این غشا به دلیل سرعت بالا در انتقال، معمولا از جنس نیتروسلولز یا پلی-وینیلیدین دی فلوراید ( PVDF) است. کاغذ PVDF به علت داشتن ویژگی اتصال به پروتئین‌های سنگین‌تر بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد. جهت انجام مرحله انتقال، ابتدا مقداری از بافر انتقال را در یک ظرف تمیز ریخته و پس از بریدن ژل، بخش متراکم کننده آن در بافر قرار داده شود. اکنون کاغذ PVDF را ابتدا در متانول و سپس در بافر انتقال خیس کرده و همچنین چندین کاغذ صافی دقیقا هم اندازه ژل و دو عدد اسفنج را که قرار است در طرفین غشا و ژل قرار بگیرند، در بافر انتقال قرار داده تا کاملا خیس شوند. سپس اجزای فوق روی هم قرار داده می‌شود. کاغذهای صافی به تعداد مساوی به همراه یک اسفنج را در دو طرف غشا و ژل قرار داده و نهایتا ساندویچ بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم بسته و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده، قرار داده می‌شود. در این مرحله تانک وسترن بلاتینگ بهتر است که در مخزنی از یخ قرار گیرد تا گرمای ناشی از جریان، در پروسه انتقال اختلالی ایجاد نکند.
نکته مهم: هیچ حباب هوایی بین ژل و غشای PVDF نباید وجود داشته باشد و حتی المکان مایعات اضافی خارج شود.


نکته مهم: هیچ حباب هوایی بین ژل و غشای PVDF نباید وجود داشته باشد و حتی المکان مایعات اضافی خارج شود.

مرحله پنجم : بلاکینگ و تشخیص با آنتی بادی اولیه و ثانویه

 پس از اتمام مرحله ترانسفر، کاغذ PVDF  به منظور حذف اتصالات غیر اختصاصی به جهت تسهیل در تشخیص درست، بهتر است حداقل یک ساعت در محلول بلاکینگ قرار گیرد. از سرم آلبومین گاوی و یا شیر خشک بدون چربی(Skim milk) می توان برای تهیه محلول بلاکینگ نیز استفاده کرد.

بعد از مرحله بلاکینگ، غشای  PVDF با رقت مناسب از محلول آنتی بادی اولیه، به مدت یک شبانه روز در دمای ۴ درجه سانتی­گراد یا دو ساعت در دمای محیط روی شیکر، انکوبه شود.  انتخاب زمان و دمای انکوبه به نوع آنتی‌­بادی بستگی دارد چرا که برخی از آنتی­‌بادی ها در دمای محیط عملکرد و خاصیت خود را از دست می­دهند.

در ادامه غشاء با بافر توئین ۲۰ یک درصد یا TBST (Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20  به مدت ۵ دقیقه جهت حذف عوامل غیراختصاصی‌­ سه مرتبه شستشو داده می شود. در این مرحله آنتی­‌بادی اولیه متصل نشده به پروتئین هدف نیز از غشا جدا می­شود.

کاغذ-غشا-PVDF وسترن بلات

غشای PVDF در محلول آنتی بادی ثانویه کانژوگه شده با آنزیم آلکالین فسفاتاز یا horseradish peroxidase با رقت مناسب آن آنتی بادی که در کاتالوگ آنتی بادی آورده شده، به مدت ۹۰ دقیقه روی شیکر انکوبه می گردد. مجدد غشاء را با بافر  TBST  به مدت ۵ دقیقه سه بار شست­‌وشو داده می شود. در نهایت آنتی بادی اولیه به پروتئین هدف و آنتی بادی ثانویه به آنزیم استفاده شونده متصل می­گردد.

مرحله ششم : شناسایی با روش ECL  (Electrochemiluminescence) و ظهور باندها بر روی فیلم   x-Ray

 اکنون پروب ­هایی که نشاندار شده و به پروتئین هدف متصل شده‌­اند، می ­بایست شناسایی گردند. روش­‌های متفاوت از جمله فلوئورسنت، رادیواکتیو، رنگ سنجی و شیمی معدنی یا  chemiluminescent مورد استفاده قرار می­گیرد.

امروزه عمدتا، از روش ECL به دلیل حساسیت و دقت بالا استفاده می شود. اساس این روش، خاصیت لومینسنتی است که به هنگام در معرض قرار گرفتن کاغذ با آنتی بادی ثانویه کونژوگه شده ایجاد میگردد. لازم به ذکر است که  میزان لومینسانس تولید شده به مقدار پروتئین بستگی دارد. در این روش، ابتدا به نسبت مساوی از دو محلول موجود در کیت ECL  که به محلول ظهور و ثبوت معروف است، بر روی کاغذ PVDF  می ریزیم. ( برای اطمینان از پوشش ECL از پیپت ۱۰۰۰ میکرولیتر استفاده می­شود)

نهایتا پس از در معرض قرار گرفتن فیلم در نور قرمز با طول موج مشخص، باندها روی فیلم X-RAY  (آشکارکننده) قابل مشاهده می شوند دقت داشته باشیم که تمامی این مراحل وسترن بلاتینک باید در تاریکی انجام شود.

پیشنهاد ما

 وسترن بلات تکنیکی است که در تحقیقات بیولوژی مخصوصاً طرح های پژوهشی گرایش های زیست شناسی و سلولی و مولکولی جهت شناسایی و بررسی بیان پروتئین هدف استفاده گسترده ای می شود. اگرچه وسترن بلات، تست بسیار کاربردی و مهم  در آزمایشگاه های تحقیقاتی و تشخیصی ست، اما همواره بدست آوردن نتایج غیرقابل انتظار در کنار خطاهای تکنیکی و انسانی در حین انجام آزمایش از مهمترین دغدغه های دانشجویان می باشد. بنابراین می بایست تکنیک وسترن بلات را با دقت بالا و در شرایط آزمایشگاهی پایدار بر اساس پروتکل ستاپ شده RUN کنید.

پیشنهاد می کنیم این تکنیک کاربردی را با مدرن ترین تجهیزات، در کنار کارشناسان با تجربه ما در مجموعه  تحقیقاتی و آزمایشگاهی هیستو‍ژنوتک انجام دهید تا کسب نتایج دقیق را با کیفیت بالا و بدون خطای انسانی تجربه کنید و وسترن بلات را به طور کاملاً حرفه ای آموزش ببینید.

مزایای تست وسترن بلات
تکنیک وسترن بلات
تکنیک وسترن بلات

برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

آموزش تکنیک وسترن بلات

مطالب مرتبط: تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC – تکنیک ایمونوسیتوشیمیآنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی
خدمات مرتبط: انجام تکنیک وسترن بلات با بانکی غنی از انواع آنتی بادی

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

هجده − 16 =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا