ژنتیک

تکنیک وسترن بلات

وسترن بلات (پروتئین بلاتینگ یا ایمنو بلاتینگ) یک روش بسیار قدرتمند و مهم برای شناسایی پروتئین ها است. از وسترن بلات اغلب در تحقیقات برای جداسازی و شناسایی پروتئین ها استفاده می شود.

برای مشاهده ویدئو کامل آموزش تکنیک وسترن بلات به انتهای مطلب مراجعه کنید یا اینجا کلیک کنید.

برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

 این تکنیک شامل ۳ مرحله می باشد:

  1. جداسازی پروتئین ها بر اساس اندازه
  2. انتقال به غشاء جامد
  3. نشاندار کردن پروتئین هدف با آنتی بادی اولیه و ثانویه مناسب جهت تشخیص

وسترن بلات انتقال پروتئین از ژل SDS-PAGE به غشا را امکان پذیر می کند. پروتئین های بلات شده یک کپی دقیق از ژل را تشکیل می دهند.

با استفاده از این روش شناسایی اختصاصی پروتئین هدف با آنتی‌بادی مناسب صورت می گیرد. ارزش قدرت تفکیک بالای ژل الکتروفورز تنها پس از ظهور وسترن بلات به کامل ترین پتانسیل خود رسید. انتقال موثر پروتئین ها از ژل به غشاء جامد بستگی زیادی به ماهیت ژل، جرم مولکولی پروتئین های منتقل شده و غشای مورد استفاده دارد.

مرحله ۱: استخراج پروتئین در تکنیک وسترن بلات

برای وسترن بلات، آماده سازی نمونه یک گام اساسی در فرآیند وسترن بلات است. تیمار مناسب نمونه ها تضمین می کند که شما قادر به شناسایی پروتئین های مورد نظر هستید. پروتئین را می توان از انواع مختلف نمونه ها مانند بافت یا سلول ها استخراج کرد.

 مراحل استخراج پروتئین در تکنیک وسترن بلات
مراحل استخراج پروتئین در تکنیک وسترن بلات

استخراج پروتئین از نمونه های سلولی

ابتدا سلول ها را تریپسینه کرده و به صورت معلق در آورده و سپس لیز سلول ها با استفاده از یک بافر لیز کننده همراه با مهار کننده پروتئاز انجام می شود. محلول لیز را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را جمع کرده و در نهایت مایع رویی (یا مخلوط پروتئین) را به یک لوله تازه منتقل می کنیم که باید روی یخ نگهداری شود یا در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد منجمد شود.

استخراج پروتئین از نمونه های بافتی

ابتدا بافت های جامد را هموژنایز کرده و سپس لیز بافت ها با استفاده از بافر لیز کننده همراه با مهار کننده پروتئاز انجام می شود در نهایت محلول لیزر را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را جمع کرده و در نهایت مایع رویی (مخلوط پروتئین) را به یک لوله تازه منتقل کنیم که باید روی یخ نگهداری شود یا در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد منجمد شود.

تعیین غلظت پروتئین ها

در نهایت غلظت پروتئین با استفاده از روش براد فورد یا تکنیک لوری تخمین زده می شود.

مرحله ۲: آماده سازی ژل، نمونه ها و انجام الکتروفورز

در این مرحله ابتدا آماده سازی ژل انجام می شود. ژل از دو بخش separation gel و stacking gel تشکیل شده است درصد انتخاب شده در این نوع ژل به اندازه پروتئین هدف بستگی دارد. پس از آماده سازی ژل نمونه ها را به همراه بافر نمونه به مدت ۵ دقیقه در ۱۰۰ درجه سانتی گراد حرارت داده می شود و سپس در چاهک های ژل تزریق می شوند و در نهایت پس از اتمام الکتروفورز، پروتئین‌ها بر روی ژل SDS-PAGE بر اساس اندازه تفکیک می شوند.

تکنیک وسترن بلات
بارگزاری نمونه ها در ژل

مرحله ۳: انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشاء در تکنیک وسترن بلات

در مرحله ترانسفر، پروتئین‌های تفکیک ‌شده بر روی ژل به کاغذ PVDF بصورت پیوسته و مرطوب منتقل می شود. بدین منظور ابتدا مقداری از بافر انتقال را در یک ظرف تمیز ریخته و ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن در بافر قرار می دهیم. کاغذ PVDF را ابتدا در متانول و سپس در بافر انتقال خیس می کنیم همچنین چندین پد صافی را که دقیقا هم اندازه ژل برش دادیم و دو عدد اسفنج را که قرار است در طرفین غشا و ژل قرار بگیرند را در بافر انتقال قرار می دهیم تا کاملا خیس شود. سپس اجزای فوق را رو هم قرار می دهیم. کاغذهای صافی به تعداد مساوی به همراه یک اسفنج را در دو طرف غشا و ژل قرار داده و نهایتا ساندویچ بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم می کنیم و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار می دهیم. در این مرحله تانک وسترن بلاتینگ بهتر است که در مخزنی از یخ قرار گیرد تا گرمای ناشی از جریان ، در پروسه انتقال خللی ایجاد نکند. (نکته: اطمینان حاصل می کنید که هیچ حباب هوایی بین ژل و غشای PVDF وجود نداشته باشد و مایعات اضافی را فشار می دهیم تا خارج شوند.

تکنیک وسترن بلات

مرحله ۴: بلاکینگ و تشخیص با آنتی بادی اولیه و ثانویه

  • پس از اتمام مرحله ترانسفر، کاغذ PVDF به منظور حذف اتصالات غیر اختصاصی و جهت تشخیص اختصاصی در محلول بلاکر به مدت یک ساعت قرار می گیرد از BSA و یا شیر خشک بدون چربی می توان برای این کار استفاده کرد
  • غشای  PVDF را در محلول آنتی بادی اولیه با رقت مناسب به مدت یک شبانه روز در ۴ºC  بر روی شیکر قرار می دهیم تا انکوبه شود.
  • سه بار شستشو غشاء با TBST به مدت ۵ دقیقه انجام می شود.
  • غشای  PVDF را در محلول آنتی بادی ثانویه کانژوگه شده با آنزیم (alkaline phosphatase or horse radish peroxidase) با رقت مناسب به مدت ۵/۱ بر روی شیکر قرار داده تا انکوبه شود .
  • سه بار شستشو غشاء با TBST به مدت ۵ دقیقه انجام می شود.
تکنیک وسترن بلات
تکنیک وسترن بلات

مرحله ۵: شناسایی با روش (Electrochemiluminescence(ECL و ظهور باندها بر روی فیلم  x-Ray

ابتدا به نسبت مساوی از دو محلول کیت ECL را بر روی کاغذ PVDF ریخته (نکته: برای اطمینان از پوشش ECL از پیپت ۱۰۰۰ میکرولیتر استفاده کنید) و سپس باندها بر روی فیلم X-RAY قابل مشاهده هستند توجه شود که تمامی این مراحل باید در تاریکی انجام شود.

برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

آموزش تکنیک وسترن بلات

مطالب مرتبط: تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC – تکنیک ایمونوسیتوشیمیآنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی
خدمات مرتبط: انجام تکنیک وسترن بلات با بانکی غنی از انواع آنتی بادی

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پانزده + 2 =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا