بافت شناسيمطالب علمی

تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC

تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC

تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC، معمولا در تشخیص و شناسایی مسیر تمایز یک تومور خاص مورد استفاده بوده است. اما امروزه از این تکنیک برای شناسایی و مکان یابی انواع پروتئین ها در بافت و سلول استفاده می شود.

استفاده از روش های تحقیقاتی ایمونولوژیک در هیستوپاتولوژی منجر به بهبودی چشمگیری در تشخیص میکروسکوپی نئوپلاسم شده است. گرچه آنالیز بافت شناسی مقاطع بافتی رنگ شده با هماتوکسیلین و ائوزین همچنان به عنوان هسته اصلی پاتولوژی باقی مانده است، اما ایمونوهیستوشیمی به ابزاری قدرتمند در اختیار پاتولوژیست ها تبدیل شده است.

ایمونوهیستوشیمی به عنوان یکی از مهم ترین تکنیک های کمکی در تشخیص بیماری های نئوپلاستیک است. همچنین این تکنیک روشی برای شناسایی ترکیبات سلولی یا بافتی (آنتی ژن ها) با استفاده از فعل و انفعالات آنتی ژن-آنتی بادی می باشد که با اتصال اختصاصی ناحیه ای از آنتی بادی به آنتی ژن و اتصال آنتی بادی ثانویه نشان دار شده به آنتی بادی اولیه انجام می گیرد.

روش های رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی شامل: استفاده از آنتی بادی های نشاندار شده با ماده فلورسنت (ایمونوفلورسانس) و یا آنتی بادی های نشاندار شده با آنزیم (ایمونوپروکسیداز) می باشد که برای شناسایی پروتئین ها و سایر مولکول ها در بافت به کار می روند.

در تشخیص های آسیب شناسی، روش های ایمونوپرکسیداز به طور گسترده برای دستیابی به اطلاعات بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد که با رنگ آمیزی H&E و میکروسکوپ نوری قابل دسترس نباشند.

در نیم قرن گذشته، پیشرفت فوق العاده ای در تولید ابزارها و سیستم های ردیابی آنتی بادی به دست آمده است. با این حال اکثر قریب به اتفاق این تلاش ها، در جهت آنالیز بیشتر بیان پروتئین به عنوان نشانگر انواع سلول، بافت یا تومور خاص مورد استفاده قرار گرفته است.

مراحل انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی:

۱:در ابتدا باید به کمک فرمالین بافت را فیکس می نمائیم. فیکس کردن بافت مورد نظر، از طریق غوطه ور کردن آن برای ۲۴ تا ۴۸ ساعت در فرمالین ۱۰ درصد انجام می شود.

۲: مرحله آبگیری: به دلیل عدم حلالیت پارافین در آب، باید قبل از غوطه ‌ور کردن بافت در پارافین مرحله آب‌گیری را انجام دهیم. بافت ها را در محلول اتانول با غلظت های ۷۰ ، ۸۰ و ۹۵ درصد هر کدام به مدت ۴۵ دقیقه قرار می دهیم سپس بافت ها را ۳ بار در اتانول ۱۰۰ درصد به صورت جداگانه هر بار ۱۰۰ دقیقه انکوبه می نمائیم.

بعد از انجام مراحل آب‌گیری، جهت شفاف سازی و شستشوی مواد مرحله قبل از زایلن استفاده می‌کنیم.

۳: بافت ها را در دو ظرف جداگانه زایلن هر کدام را به مدت یک ساعت انکوبه می کنیم.

۴: بافت ها را به ترتیب در سه ظرف جداگانه پارافین هر کدام به مدت یک ساعت غوطه ور می کنیم.

۵: بافت ها را داخل بلوک های پارافینی جایگذاری کرده و سپس بوسیله میکروتوم برش داده و به لام انتقال می دهیم.

پس از چسبیدن بافت به لام بایستی پارافین را از بافت جدا کنیم که نیاز به آبدهی بافت می باشد. مرحله آبدهی برعکس مرحله آبگیری انجام می شود.

۶: دپارافینه کردن بافت ها: لام ها  را در دو ظرف جداگانه زایلن هر کدام را به مدت ۵ دقیقه قرار داده سپس لام ها را دوبار و هربار به مدت ۳ دقیقه در اتانول ۱۰۰ درصد و سپس یک بار و به مدت ۳ دقیقه در هر یک از غلظت های ۵۰ ، ۷۰ و ۹۵ اتانول قرار می دهیم سپس لام ها را به مدت یک شب در دمای اتاق خشک می نمائیم.

۷: به منظور بلاک کردن فعالیت پراکسیداز سلولی لام ها را در محلول متانول حاوی آب اکسیژنه ۳ درصد برای مدت ۱۰ دقیقه انکوبه می کنیم. و سپس دوبار و هر بار ۵ دقیقه بوسیله PBS شستشو می دهیم.

۸: جهت در معرض قرار گرفتن اپیتوپ های آنتی ژن ، لام ها را داخل یک ظرف قرار داده و بر روی آن بافر سیترات ریخته و ظرف را برای مدت ۱۰ دقیقه  در ۹۵ تا ۱۰۰ درجه سانتی گراد حرارت می دهیم سپس ظرف را برای مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق می گذاریم تا سرد شود.

۹: لام ها را دو بار و هر بار برای مدت ۵ دقیقه با PBS شستشو می دهیم.

۱۰: مقدار مناسبی از بلاکینگ بافر (e.g. 10% fetal bovine serum in PBS) بر روی هر لام ریخته و سپس برای مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار داداه و سپس با PBS شستشو می دهیم.

۱۱: مقدار مناسبی از آنتی بادی اولیه رقیق شده را بر روی بافت ها ریخته و برای یک ساعت در دمای اتاق قرار می دهیم سپس دوبار با PBS و هر بار ۵ دقیقه شستشو می دهیم.

۱۲: مقدار مناسبی از آنتی بادی ثانویه رقیق شده را بر روی هر لام ریخته و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار می دهیم سپس لام ها را دو بار با PBS و هر بار به مدت ۵ دقیقه شستشو می دهیم.

۱۳: مقدار مناسبی از Sav-HRP رقیق شده را بر روی بافت ها ریخته و برای ۳۰ دقیقه در تاریکی قرار داده سپس لام ها را دو بار با PBS و هر بار به مدت ۵ دقیقه شستشو می دهیم.

۱۴: بر روی هر بافت مقدار مناسبی از محلول DAB ریخته و ۵ دقیقه انکوبه کرده و سپس ۳ بار با PBS شستشو می دهیم.

۱۵: لام ها را برای دو دقیقه داخل هماتوکسیلین قرار داده و سپس با آب شستشو می دهیم.

۱۶: لام ها  را جهت آبگیری در اتانول ۹۵ و ۱۰۰ درصد هر کدام دو بار و هر بار ۵ دقیقه قرار می دهیم.

۱۷: لام ها را جهت شفاف شدن داخل زایلن قرارداده و سپس لام ها را مونت می کنیم.

خدمات مرتبط: بافت‌ شناسی، مهندسی بافت و رنگ آمیزی های پاتولوژی

برچسب ها
نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دوازده − دو =

دکمه بازگشت به بالا
بستن