بافت شناسیمطالب علمی

آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی پریودیک اسید شیف (Periodic acid–Schiff) در آزمایشگاه بافت شناسی

کاربرد ها، پروتکل و مراحل رنگ آمیزی و تفسیر نتایج رنگ آمیزی احتصاصی پاس

⭐آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه‌‌ای از رنگ آمیزی اختصاصی پریودیک اسید شیف در بافت شناسی

در بافت شناسی طیف وسیعی از رنگ آمیزی های تخصصی جهت تشخیص انواع بیماری ها و بیومارکرها استفاده می شود. یکی از رنگ‌آمیزی‌های متداول تخصصی بافت، رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف است که به رنگ آمیزی پاس (PAS) شناخته شده است. هنگامی که بین معرف پریودیک اسید شیف (Periodic acid–Schiff) و کربوهیدرات‌های سلول های بافت واکنش اکسیداتیو (Oxidative process) روی می‌دهد. رنگ پاس سبب اکسید شدن پلی ساکاریدها شده و در نتیجه، یک ترکیب اکسیدازی بنام آلدئید تولید می گردد. و آلدئیدها به دلیل حضور معرف بی‌رنگ شیف (Schiff Reagent) تغییر رنگ داده و طیف گسترده ای از رنگهای صورتی تا بنفش را نشان می‌دهند. رنگ آمیزی پاس در آزمایشگاه بافت شناسی و پاتولوژی جهت رنگ آمیزی بافت کبد و تشخیص انواع سرطان ها بسیار کاربرد دارد. در ادامه به تفصیل درباره کاربردها و پروتکل رنگ آمیزی سخن گفته ایم.

تاریخچه رنگ‌آمیزی اختصاصی پریودیک اسید شیف

جوزف فورد آنتونی مک‌مانوس ، Joseph Forde Anthony McManus پاتولوژیست کانادایی به خاطر فرمولاسیون یکی از متداول ترین رنگ آمیزی ها یعنی رنگ McManus Periodic acid-Schiff شناخته شده است. جوزف مک مانوس در دهه ۱۹۴۰ و ۱۹۵۰ در زمینه پاتولوژی پیشگام بوده است. نتیجه مشاهدات او روی موروفولوژی کلیه و بیماریهای مرتبط با آن و همچنین دیالیز کلیه پروتکل رنگ آمیزی پاس می باشد.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی پریودیک اسید شیف در بافت شناسی

از تکنیک رنگ آمیزی PAS در طیف گسترده ای از بخش های آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی مورد استفاده قرار گرفته است. این کاربردها عبارتند از:
در بخش سیتولوژی، این روش رنگ آمیزی برای شناسایی غیر افتراقی و تشخیص انواع بافت های توموری و سرطانی مانند سرطان پروستات، آدنوکارسینوماهای تولید کننده موسین‌های خنثی کاربرد دارد.


در حوزه قارچ شناسی برای تشخیص بیماری های قارچی از جمله شناسایی عفونت های کاندیدا آلبیکنس، آسپرژیلوس فومیگاتوس و کریپتوکوکوس نئوفورمانس با نشان دادن هیف های قارچی در نمونه بافتی آلوده از رنگ آمیزی به روش پریودیک اسید شیف (PAS) مورد استفاده قرار می‌گیرد. البته این نوع رنگ آمیزی فقط روی قارچ های زنده کاربرد دارد.
در آسیب شناسی می توان از این تکنیک برای آسیب شناسی کبد، پانکراس و کلیه در نظر گرفته می شود. در نمونه های بیوپسی ریه نوزادان مبتلا به گلیکوژنز (Pulmonary interstitial glycogenosis; PIG) برای شناسایی گلیکوژن نیز کاربرد دارد. رنگ پاس جهت شناسایی گلیکوژن، سلولز و نشاسته کاربرد دارد. بنابراین برای یافتن باقیمانده های گلیکوژنی در نمونه کبدی فرد مشکوک به بیماری ذخیره ای گلیکوژن استفاده می شود.

جهت مشاوره رایگان با ما تماس بگیرید
۰۲۱۶۶۱۲۱۹۸۸ 

نگاهی اجمالی به بافت کبد رنگ شده با پریودیک اسید شیف

کبد بزرگترین ارگان بدن مهره داران است که مواد سمی را از سیستم گردش خون جمع آوری کرده، حفظ میزان قند خون و چندین فعالیت حیاتی دیگر را انجام می دهد. وظیفه دیگر کبد در متابولیسم شامل تنظیم ذخیره گلیکوژن، تجزیه سلولهای قرمز خون و تولید هورمونها می باشد. گلیکوژن پلی ساکاریدی با واحد مونومری گلوکز است که به عنوان شکلی از ذخیره انرژی در بدن حیوانات، قارچ ها و باکتری ها عمل می کند. عدم متابولیسم صحیح گلیکوژن در کبد ناشی از کمبود آنزیم های لازم برای سنتز و تجزیه گلیکوژن به عنوان بیماریهای ذخیره ای گلیکوژن شناخته شده است. کبد حدودا ۱۰۰ گرم گلیکوژن را از طریق گلیکوژنز از لاکتیک اسید (تشکیل کلیکوژن از گلوکز)سنتز و نگهداری می کند. زمانی که بدن نیازمند گلوکز است، کبد از طریق فرایند گلیکوژنولیز (شکستن گلیکوژن به گلوکز)، گلوکز را به خون آزاد می کند.

رنگ-آمیزی-پاس-در-بافت-کبد-هیستوژنوتک
تجمعات گلیکوژن در هپاتوسیت‌های بافت کبد با رنگ آمیزی پاس نشان داده شده است

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی پاس

در آزمایشگاه هیستوپاتولوژی، تکنیک رنگ‌آمیزی PAS جهت رنگ آمیزی بافت‌هایی که حاوی مقادیر نسبتا بالایی از پلی ساکاریدها مانند گلیکوژن و مواد موکوسی ( گلیکوپروتئینها، گلیکولیپیدها و موسین ها) هستند، کاربرد دارد. عمده این بافت ها، بافت همبند، موکوس، گلیکوکالیکس (Glycocalyx) هستند.

پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی پریودیک اسید شیف در بافت‌شناسی

پروتکل های مختلف برای انجام تکنیک رنگ آمیزی پاس وجود دارد که در اینجا یکی از روش های ستاپ شده را توضیح می دهیم.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ‌آمیزی اختصاصی پاس

  1. برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۳-۵ میکرون تهیه می‌کنیم.
  2. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می‌بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با اتانول این مرحله انجام می‌شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
  3. آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های مختلف از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
  4. اکنون لام‌های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی پاس

  1. ابتدا پارافین زدایی و هیدراسیون با آب دیونیزه انجام می‌دهیم.
  2. به مدت ۵ دقیقه لام‌ها را در محلول پریودیک اسید (Periodic Acid) و در دمای محیط انکوبه می کنیم. چنانچه نمونه بافتی پوست و کلیه باشد می توانیم زمان انکوبه را تا ۱۵ دقیقه افزایش دهیم.

    محلول پریودیک اسید ۰.۵% با حل کردن ۰.۵ گرم از پودر پریودیک اسید در ۱۰۰ سی سی آب مقطر تهیه می شود.
  3. اکنون لام‌ها را چندین مرتبه (حداقل چهار بار) با آب مقطر شست‌وشو می‌دهیم.
  4. انکوباسیون لام ها را به مدت زمان ۱۵ الی ۳۰ دقیقه در معرف بی‌رنگ شیف (Schiff Reagent) و در دمای محیط انجام می‌دهیم و سپس پنج دقیقه با آب شست‌وشو می‌دهیم.

    تست تاییدیه معرف شیف به این صورت است که چند قطره از معرف را به ۱۰ سی سی از فرمالین ۱۰ درصد اضافه می کنیم. چنانچه تغییر رنگ به بنفش به سرعت انجام شود، کیفیت معرف شیف قابل قبول است. معرف با کیفیت پایین و غیر قابل استفاده، پس از مدت زمان طولانی تری تغییر رنگ را نشان می دهد و رنگ آن بنفش مایل به آبی است.
  5. نمونه‌ها را به مدت ۱۵ ثانیه در محلول سدیم بورات ۰.۳% (۰.۳ گرم در ۱۰۰ سی سی آب) قرار داده و پس از آن چهار مرتبه با آب مقطر آبکشی می کنیم.
  6. به مدت ۳۰ ثانیه نمونه‌ها را در محلول هماتوکسیلین قرار می دهیم.
  7. چندین مرتبه با جریان ملایم آب، آبکشی انجام می دهیم و اجازه میدهیم تا در دمای محیط خشک شوند.
  8. اکنون نمونه های پارافینی را دهیدراته کرده و سپس با زایلین و تولوئن شفاف سازی می کنیم و پس از مونت کردن لام‌ها با چسب انتلان و لامل، با میکروسکوپ نوری اسلایدها را بررسی می کنیم.

تجهیزات و مواد مورد نیاز در تکنیک رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف

مواد مورد نیاز

  • پودر پریودیک اسید
  • فرمالین ۱۰ درصد
  • معرف بی­رنگ شیف
  • محلول اتانول-فرمالین
  • رنگ افتراقی هماتوکسیلین
  • چسب انتلان
  • زایلین
  • تولوئن

تجهیزات مورد نیاز

  • دستگاه گرمکن اسلاید
  • میکروتوم
  • جار رنگ­‌آمیزی لام
  • میکروسکوپ نوری
  • لام و لامل

جهت مطالعه بیشتر ، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف

بررسی و آنالیز لام های رنگ آمیزی شده از نمونه های بیولوژیکی با استفاده از میکروسکوپ نوری توسط پاتولوژیست انجام می شود. نمونه هایی که نتیجه آن PAS مثبت است از قیبل گلیکوژن، موسین ها وغشاهای پایه، رنگ صورتی تا قرمز را نشان می دهند. هسته سلول ها به رنگ آبی دیده می شود. در نمونه های آلوده به قارچ نتیجه تست به رنگ قرمز قابل مشاهده می باشد. نمونه هایی از بافت های مختلف رنگ آمیزی شده با تکنیک پاس در تصاویر زیر نشان داده شده است.

تشخیص لنفوسیت ها و موکوپلی ساکاریدها با استفاده از رنگ آمیزی PAS

قشر تخمدان حاوی فولیکول های متعددی است که در یک استرومای ضخیم قرار گرفته اند. بیشتر فولیکول ها فولیکول های اولیه در حال استراحت هستند. فولیکول‌هایی که تحریک شده‌اند در مراحل اولیه و ثانویه پیشرفت می‌کنند تا به فولیکول‌های ثالث یا Graafian بالغ تبدیل شوند، که در آن یک حفره بزرگ پر از مایع به نام آنتروم، توسط لایه‌های زیادی از سلول‌های گرانولوزا احاطه شده است. سلول های استرومایی اطراف فولیکول، theca interna که استروژن ترشح می کند و theca interna را تشکیل می دهند. کومولوس اوفوروس حاوی تخمک به ندرت در بخش های تصادفی مانند این ظاهر می شود.

رنگ آمیزی ( Periodic acid-Schiff (PAS برای بررسی تخمدان در مراحل مختلف رشد و نمو

شناسایی گلیکوژن در مقابل ماده مخاطی خنثی در تشخیص افتراقی آدنوکارسینوم در مقابل کارسینوم سلول سنگفرشی ضعیف یا آدنوکارسینوم در مقابل مزوتلیوما مهم است، زیرا گلیکوژن در همه این سرطان ها وجود دارد در حالی که مواد مخاطی خنثی از نظر تئوری فقط در آدنوکارسینوم یافت می شوند. ترکیبی از واکنش رنگ آمیزی PAS و پاس با هضم دیاستاز (PASD) بسیار مفید است. به طور کلی، گلیکوژن را می توان توسط دیاستاز هضم کرد در حالی که مواد مخاطی خنثی نمی توانند از این طریق از بین بروند. از این رو، گلیکوژن یک الگوی رنگ‌آمیزی پاس مثبت و منفی هضم دیاستاز را نشان می‌دهد.

رنگ‌آمیزی پاس گلیکوژن در نمونه بافتی کبد فیکس شده با فرمالین. تصویر سمت چپ تیمار با دیاستاز و تصویر سمت راست بدون هضم دیاستازی است.

ارائه خدمات رنگ آمیزی اختصاصی پریودیک اسید شیف در آزمایشگاه بافت شناسی

سلول‌های هر بافتی از بدن موجود زنده یک یا چند رنگ آمیزی اختصاصی خود را دارد که مطالعه و بررسی بافت را در مسیر تحقیقات و تشخیص در زمینه بیماری‌های مختلف تسهیل می‌کند. یکی دیگر از خدمات مجموعه آزمایشگاهی هیستوژنوتک، رنگ آمیزی های تخصصی و عمومی از جمله رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف (PAS) در بخش بافت شناسی توسط کارشناسان آزمایشگاه باتجربه و متخصصین خبره می باشد.

آزمایشگاه بافت شناسی هیستوژنوتک با استفاده از تجهیزات مطابق با استانداردهای آزمایشگاهی در ارائه خدمات رنگ آمیزی عمومی و اختصاصی بافت شناسی آماده همکاری با محققان، دانشجویان، اساتید می باشد. با ارائه نتایج آنالیز شده، کلیپ های آموزشی و پروتکل های رنگ آمیزی آماده خدمت رسانی است. شرکت بافت و ژن پاسارگاد قادر است کلیه مراحل صفر تا صد رنگ آمیزی های اختصاصی بافت را روی کلیه بافت های حیوانی و انسانی ارسال شده از سوی محققان و آزمایشگاه های تشخیصی پزشکی پاتوبیولوژی انجام دهد.

جمع بندی

از جمله رنگ آمیزی های اختصاصی در بافت شناسی، تکنیک PAS است که اساس آن اکسید شدن کربوهیدرات های نمونه های بیولوژیکی در حضور محلول اختصاصی شیف است که نتیجه آن شناسایی کربوهیدرات ها و ترکیبات غنی از کربوهیدرات هستند که نهایتا منجر به تشخیص و تحقیق انواع بیماریها در بخش های مختلف آزمایشگاههای تشخیص طبی: سیتولوژی، آسیب شناسی، مطالعات قارچ شناسی می باشد. رنگ آمیزی پاس پلی ساکاریدها، موسین، گلیکوژن، گلیکوپروتئین ها ، غشای پایه و برخی قارچ ها در بافت ها را شناسایی می کند.

سوالات متداول

✔️کاربرد رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف چیست؟

در بافت شناسی جهت تشخیص بافت های آلدئیدی و موسینی کاربرد دارد.

✔️شرایط نگهداری معرف شیف به چه صورت است؟

در دمای ۲ الی ۸ درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود.

دانلود PDF

دانلود pdf
نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

سه × چهار =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا