بافت شناسي

تست تانل

تست تانل

تست تانل روشی برای شناسایی و اندازه گیری سلول های آپوپتوز شده است که به طور گسترده ای برای تشخیص و اندازه گیری آپوپتوز و همچنین تشخیص شکستگی های DNA مورد استفاده قرار می گیرد.

(TUNEL (deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labelling

به مرگ برنامه ریزی شده سلول آپوپتوز گفته می شود که یک فرآیند سلولی عادی محسوب می شود. همانطور که از این اصطلاح پیداست، آپوپتوز مجموعه ای از رویدادهای کنترل شده و بسیار تنظیم شده است که منجر به از بین رفتن سلول های ناخواسته می شود. عدم شروع آپوپتوز می تواند بسیاری از بیماری ها را به وجود آورد، که شایع ترین آنها بیماری ورم مفاصل و سرطان است.


تست تانل رایج ترین روش مورد استفاده برای سنجش قطعات شکسته ی DNA ناشی از مرگ سلولی است. آپوپتوز توسط فعال سازی نوکلئاز و قطعه قطعه شدن DNA منجر به تشکیل بسیاری از انتهاهای باز ‘DNA ۳-هیدروکسیل (OH) می شود که برچسب گذاری نهایی این قطعات با استفاده از فلوروفورها را تسهیل می کند. میزان فلورسانس را می توان با میکروسکوپ فلورسانس یا فلوسیتومتری تشخیص داد. روش تانل مبتنی بر استفاده از آنزیمی به نام TdT) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) است. این آنزیم واکنش اتصال مستقل از الگوی دئوکسی نوکلئوتید های متصل به یک فلوروکروم را به انتهای ‘۳-hydroxyl از دو رشته DNA های شکسته را کاتالیز می کند. روش TUNEL امکان شناسایی آپوپتوز در بخش های مختلف بافت را فراهم می کند. تکه تکه شدن DNA مشخصه بارز آپوپتوز است.

تست تانل

این روش با استفاده از شناسایی انتهای صاف DNA دو رشته ای به روشی مستقل از الگو عمل می کند. آنزیم TdT مورد استفاده برای این روش امکان افزودن dUTP های دارای برچسب را در ترمینال ‘۳-OH DNA قطعه ی شکسته شده فراهم می آورد. این قطعات دارای برچسب را می توان با استفاده از تکنیک های ایمونوهیستوشیمی در محل شناسایی کرد.

روش TUNEL دارای سه مرحله ی کلی است

آماده سازی نمونه
تانل در هر نوع نمونه (مقاطع بافتی، سوسپانسیون سلولی، رده های سلولی) قابل انجام است. لازم است نمونه را با یک فیکساتور مناسب (۴-۱٪ پارافرمالدهید) تثبیت کنیم و با متانول یا Tween-20 نفوذ پذیر کنیم. نمونه ها می توانند در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد برای استفاده بیشتر ذخیره شوند یا می توانند مستقیماً برای مرحله بعدی ادامه دهند.

رنگ آمیزی TUNEL
تمام نمونه ها برای مدت زمان مشخصی با مخلوط آنزیم TdT و آنتی بادی، انکوبه می شوند. فلوروکروم های DNA، مانند یدید پروپیدیم برای مشخص کردن هسته استفاده می شوند.

آنالیز
نتایج می تواند بسته به نوع نمونه از طریق فلوسیتومتری (سلول) یا میکروسکوپ فلورسنت (بافت) مشاهده شود.

تست تانل مراحل انجام

۱- دپارافینه کردن لام ها: لام ها را دو بار و هر بار ۵ دقیقه در زایلن قرار داده و سپس در اتانول ۱۰۰ و ۹۵ درصد هر کدام به مدت ۳ دقیقه قرار میدهیم.

۲- لام ها را دو بار و هر بار دو دقیقه با PBS-Tween 20 شستشو می دهیم.

۳- به منظور بلاک کردن پراکسیداز لام ها را برای مدت ده دقیقه در محلول PBS حاوی H2O2
۳ درصد انکوبه نموده و سپس به وسیله ی PBS-Tween 20 سه بار و هر بار دو دقیقه شستشو می دهیم.

۴- لام ها برای ۱۰ دقیقه در TdT Reaction Buffer انکوبه می کنیم.

۵- انکوبه کردن لام ها در TdT Reaction Mixture برای ۱ تا ۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه و سپس با stop wash buffer برای ۱ دقیقه شستشو داده سپس بوسیله ی PBS-Tween 20 سه بار و هر بار دو دقیقه شستشو می دهیم.

۶- لام ها را در Streptavidin-HRP برای ۲۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم سپس به وسیله ی PBS-Tween 20 سه بار و هر بار دو دقیقه شستشو می دهیم.

۷- لام ها را برای ۱ تا ۲ دقیقه با DAB انکوبه می کنیم و سپس با آب شستشو می دهیم.

۸- لام ها را برای ۳۰ ثانیه در هماتوکسیلین قرار می دهیم و سپس با آب شستشو داده و به وسیله اتانول ۹۵ و ۱۰۰ درصد هر کدام برای ۳ دقیقه آبگیری می نمائیم.

۹- لام ها را جهت شفاف سازی بافت ها دو بار و هر بار ۵ دقیقه در زایلن قرار داده و سپس مونت می کنیم.

مطالب مرتبط: تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHCتکنیک ایمونوسیتوشیمی ICC

خدمات مرتبط: بافت‌ شناسی، مهندسی بافت و رنگ آمیزی های پاتولوژی

برچسب ها
نمایش بیشتر

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

1 × یک =

دکمه بازگشت به بالا
بستن