مشاهده مستقیم نمونه قارچی
جداسازی و کشت قارچ ها از این رو حائز اهمیت است که عفونت های قارچی در انسان به شکل های متفاوتی همچون انواع کچلی ها تا عفونت های منتشره قابل بررسی می باشد. با افزایش سندرم های نقص ایمنی و همچنین استفاده از داروهای سرکوبگر سیستم ایمنی و تغییر عادات زندگی، عفونت های قارچی شروع به زیاد شدن کردند که یکی از مهم ترین مثال های آن شیوع قارچ سیاه (موکورومایکوزیس) در بین بیماران کووید۱۹ که تحت درمان با داروهای سرکوبگر سیستم ایمنی بودند، می باشد.
هرچند که استفاده از داروهای ضد قارچی تا میزان زیادی در کنترل این نوع عفونت ها نقش ایفا کرده است اما نحوه تشخیص دقیق و ردیابی زودهنگام این نوع درگیری میتواند در تسریع و موفقیت روند درمان نقش ویژه ای داشته باشد. لذا تلاش کردیم تا در این مقاله روش های مهم در جداسازی و کشت قارچ ها را بررسی نماییم
مشاهده مستقیم نمونه آلوده به قارچ از چندین جهت از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است، چرا که رشد قارچ در محیط کشت با سرعت پائینی انجام می شود و این باعث می شود که با یک رنگ آمیزی سریع بتوان یک گزارش سریع به پزشک داد که یقینا سریع شدن درمان را در پی دارد. برخی مواقع بررسی خصوصیات مورفولوژیک قارچی در نمونه رنگ آمیزی شده می تواند شاهدی برای تشخیص قطعی قارچ مورد نظر باشد.
پس می توان نتیجه گرفت که رنگ آمیزی و مشاهده مستقیم قارچ علاوه بر اینکه به پزشک برای درمان کمک می کند ، می تواند به پرسنل آزمایشگاه میکروبیولوژی نیز در تشخیص صحیح ارگانیسم کمک می کند. یکی دیگر از فواید رنگ آمیزی مستقیم بررسی سلول های التهابی و تجمع آنهاست که حتی در صورتی که قارچ دیده نشود نشان دهنده عفونت است.
آماده سازی KOH با رنگ کالکوفلورسفید
از آماده سازی توسط پتاسیم هیدروکسید (KOH) برای ردیابی عناصر قارچی در طیف وسیعی از نمونه بالینی همچون پوست، ناخن، مو، خلط، ادرار تغلیظ شده و بافت استفاده نمود.
برای این کار از %۱۰-۲۰ KOH به همراه نمونه مورد نظر بر روی لام قرار داده و یک لامل نیز بر روی نمونه قرار داده می شود. سپس لام توسط میکروسکوپ نوری با عدسی ۱۰X (LPF) مشاهده می نمائیم. پتاسیم هیدروکسید با حل نمودن کراتین و سایر مواد سلولی مشاهده ساختارهای قارچی را ممکن می سازد.
رنگ کالکفلور سفید به عنوان یک رنگ فلورسنت به همراه KOH منجر به مشاهده مناسب نمونه قارچی می شود. رنگ فلورسنت کالکفلور سفید با اتصال به پلی ساکارید های دیواره قارچی و ایجاد رنگ سفید-آبی و یا سبز (بسته به نوع فیلترهای میکروسکوپ) منجر به دیده شدن قارچ می شود.
رنگامیزی جوهر هندی (India Ink)
به صورت سنتی، استفاده از جوهر هندی برای بررسی مایع مغزی-نخاعی (CSF) و سایر مایعات استریل بدن به منظور ردیابی مخمرهای دارای کپسول همچون کریپتوکوک نئوفورمانس استفاده شده است. یک قطره از جوهر هندی به همراه یک قطره از رسوب سانتریفیوژ شده ی نمونه بالینی کافی است تا ارگانیسم کپسول دار زیر میکروسکوپ نوری دیده شود. مخمرهایی که در CSF با کپسول بزرگی پوشانده شده اند نشان دهنده درگیری بیمار با مننژیت ناشی از کریپتوکوک نئوفورمانس می باشد.
تست آنتی ژنی کریپتوکوکال
هر چند که فقط ۵۰% از بیماران مبتلا به مننژیت کریپتوکوک نئوفورمانس در رنگ آمیزی توسط جوهر هندی مثبت گزارش می شوند، برای حل این مشکل در بسیاری از آزمایشگاه ها تست بررسی آنتی ژن کریپتوکوکال جایگزین روش قدیمی جوهر هندی شده است. از تست ردیابی آنتی ژن کریپتوکوکال برای بررسی آنتی ژن پلی ساکاریدی کپسول کریپتوکوک نئوفورمانس در رسوب CSF و سرم خون استفاده می نمایند.
سایر روش های رنگ آمیزی
- رنگ آمیزی گرم: این روش برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود و در صورت وجود قارچ در نمونه می توان آن را نیز مشاهده نمود.
- رنگ آمیزی اسید-فست: از این رنگ آمیزی که برای مشاهده مایکوباکتریوم ها استفاده می شود می توان برای مشاهده بلاستومایسس درماتیدیس را نیز فراهم نمود.
- رنگ آمیزی پاپانیکولا: بیشترین استفاده از پاپانیکولا در مشاهده بدخیمی های سلولی است، در رنگ آمیزی پاپانیکولا نیز می توان عناصر قارچی را مشاهده نمود.
- رنگ آمیزی رایت Wright: از این رنگ آمیزی به صورت روتین برای رنگ آمیزی خون محیطی و آسپیره مغز استخوان استفاده می شود. از این رنگ آمیزی برای مشاهده هیستوپلاسما کپسولاتوم و کریپتوکوک نئوفورمانس می توان استفاده نمود.
همچنین سایر رنگ آمیزی ها همچون پریودیک اسید-شیف (PAS)، گوموری متنامین سیلور (GMS) و موسی کارمین که می توان در قارچ شناسی استفاده نمود نام برد.
جداسازی و کشت قارچ ها
کشت نمونه قارچ
پس از رنگ آمیزی عناصر قارچی بدون اینکه زمان از دست برود باید سریعا کشت انجام پذیرد. زنده ماندن قارچ با گذشت زمان و رشد سایر باکتری ها و قارچ ها تحت تاثیر قرار می گیرد.
زمانی که تاخیر در کشت به هر دلیلی انجام شود، نمونه را می توان در یخچال نگهداری نمود ( به جز خون، مایع CSF، نمونه های پوست، مو و ناخن). همچنین برای کشت نمونه های قارچی نیازی به تغلیظ نمونه نمی باشد به استثناء مایعات بیش از ۵ میلی لیتر مثل ادرار.
برای کشت برخی از نمونه های قارچی همچون نمونه خلط که دارای چگالی و ویسکوزیته ی بالایی هستند از مواد هموژن کننده نیز می توان بهره گرفت.
برای اپتیمم جداسازی قارچ ها بهتر است از محیط پایه آگار استفاده شود. معمول ترین محیط کشت برای جداسازی اولیه نمونه های قارچی، محیط سابرودکستروز آگار و عصاره قلب و مغز (BHI) می باشد
برای یک کشت موفق، بهتر است این محیط ها را توسط ۵-۱۰% گلبول قرمز گوسفندی غنی نمود. از محیط های انتخابی-اختصاصی حاوی آنتی بیوتیک برای برخی از نمونه ها که حدس زده می شود با باکتری یا قارچ دیگری آلودگی دارند نیز می توان بهره گرفت. آنتی بیوتیک هایی همچون کلرامفنیکل، استرپتومایسین و یا پنی سیلین برای مهار رشد باکتری ها قابل استفاده و از سیکلوهگزامید برای مهار رشد قارچ های آلوده کننده می توان استفاده نمود.
کشت قارچ در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد و یا دمای اتاق قابل انجام است اما دمای ۳۰ درجه نسبت به دمای اتاق ارجحیت دارد. رطوبت ۴۰-۵۰ درصد برای جلوگیری از خشک شدن محیط کشت استفاده می شود که اینکار با قراردادن ظرف آب در انکوباتور قابل انجام است. محیط کشت به مدت ۳۰ روز در انکوباتور قرار داده می شوند و حداقل ۳ بار در هفته بررسی می شوند. در صورتی نمونه برای بررسی درماتوفیت ها استفاده شود، محیط کشت حداقل ۶ هفته در دمای اتاق نگهداری می شوند.
روش کشت اسلاید کالچر
برای این نوع کشت ابتدا یک پلیت حاوی آب نیاز است. سپس یک لام استریل برداشته و روی آن قطعه مربعی شکل از محیط سابرودکستروز آگار قرار می دهیم. بعد از آن یک لوله ی U شکل در محیط قرار داده و لام را بر روی آن قرار می دهیم. سمپل قارچی مورد نظر را برای بررسی قارچ ها ابتدا به محیط روی لام تزریق نموده و روی آن را با یک لامل استریل می پوشانیم. پلیت ها را در محیط آزمایشگاه برای مدت حداقل ۱ هفته نگهداری می کنیم. با مشاهده مستقیم لامل می توان رشته های قارچی مورد نظر را مشاهده نمود.
مطالب مرتبط: بررسی و اندازه گیری بیوفیلم باکتریایی – آلودگی میکروبی در نمونه های مختلف – تست حساسیت آنتی بیوتیک
خدمات مرتبط: خدمات میکروبیولوژی – خدمات پژوهشی در حوزه علم بیوتکنولوژی – تولید پروتئین های نوترکیب
