جنین شناسی

لقاح آزمایشگاهی IVF

نحوه انجام تکنیک لقاح آزمایشگاهی IVF

ناباروری مساله ای پیش روی رشد جمعیت

ناباروری یکی از مهمترین بحران های زندگی است که به عنوان یک مساله جدی می تواند به روند رشد جمعیت و سلامت جامعه صدمه بزند. اختلال عملکرد تولید مثل زنان حدود ۴۰ درصد از موارد ناباروری انسان را تشکیل می دهد. اگرچه جنبه های مولکولی این اختلالات هنوز مشخص نیست ولی استفاده از مدل های حیوانی در دهه های گذشته خود را به عنوان ابزار قدرتمندی در درک ناباروری زنان نشان داده است. توسعه فن آوری ناک اوت ژنی و ایجاد بیش از ۳۰۰ مدل حیوانی مختلف در چند سال اخیر، مطالعات بیولوژی تولید مثلی را میسر ساخته است. به طور مثال برای القای مدل pco (سندرم تخمدان پلی کیستیک) در حیوانات آزمایشگاهی از روش‌های مصنوعی مختلفی استفاده شده است. این مدل‌های حیوانی می‌تواند ویژگی‌های کلیدی PCOS، مانند هایپرآندروژنیسم، فولیکول‌های آنترال بیش از حد، چرخه جنسی نامنظم و علائم متابولیک را نشان دهند.

مدل های حیوانی درمان ناباروری

تخمین زده می شود که ۱۰ تا ۱۵ درصد مردان نابارور از آزواسپرمی رنج می برند. در مطالعات ناباروری مردان مطالعات حیوانی از جمله القای مدل آزواسپرمی به روش های مختلف می تواند بسیار حائز اهمیت باشد. آزواسپرمی وضعیتی است که با فقدان اسپرماتوزوا در نمونه منی انزال شده مشخص می شود. این وضعیت ممکن است آزواسپرمی غیرانسدادی به دلیل شکست اسپرم زایی یا انسداد در سیستم مجرای دفران باشد.

دو روش رایج برای ایجاد مدل آزواسپرمی در حیوانات آزمایشگاهی عبارتند از تزریق بوسولفان و قرار گرفتن در معرض هیپرترمی که می تواند باعث آسیب DNA و اثرات بازدارنده بر رشد سلولی شود، همچنین این ترکیبات از تقسیم و تمایز سلول های بنیادی اسپرماتوگونیال جلوگیری می کند و باعث آپوپتوز در بیضه می شود.

لقاح آزمایشگاهی IVF

تعریف IVF

واژه IVF مخفف In Vitro Fertilization به معنی “بارور ساختن تخمک در آزمایشگاه” است. پیدایش لقاح آزمایشگاهی IVF در حیوانات و انسان ها به معنای تغییر شرایط محیطی است. بطور طبیعی در پستانداران، لقاح در مجرای تخمک مادر اتفاق می افتد، جایی که شرایط منحصر به فردی برای تضمین برخورد گامت ها و مراحل اولیه رشد جنین وجود دارد.

در IVF ، یک برنامه ریزی مجدد اپی ژنتیکی بزرگ انجام می شود که برای سرنوشت طبیعی جنین بسیار مهم است. این برنامه ریزی نسبت به تغییرات شرایط محیطی از جمله تغذیه، نور، دما، تنش اکسیژن، سیگنال دهی جنین-مادر، و عدم وجود محافظت کلی در برابر عناصر خارجی که می تواند تأثیر گذار باشد، بسیار آسیب پذیر است. به طور مثال ارتباط سوءتغذیه مادر در دوران بارداری و خطر ابتلا به برخی بیماری ها در بزرگسالی گزارش شده است، و در مطالعه ای دیگر بر روی موش‌ها تأیید شده که سوء تغذیه و رژیم‌های غذایی هیپوپروتئینی که فقط در مرحله قبل از لانه گزینی انجام می‌شود، منجر به تغییر رشد، مانند وزن کم هنگام تولد و فشار خون غیرطبیعی می‌شود.

موارد استفاده از IVF در درمان ناباروری

در آندومتریوز وخیم، تعداد کم اسپرم، مشکلات مربوط به رحم و لوله‌های رحمی، مشکلات مربوط به تخمک گذاری،
عدم توانایی اسپرم در نفوذ به مخاط گردن رحمی باید از IVF برای درمان ناباروری استفاده نمود. یکی از مزایای روش IVF این است که می­ توان پیش از انتقال جنین به رحم، سلول های جنینی را از لحاظ وجود اختلالات ژنتیکی بررسی نمود و از ورود آن به رحم جلوگیری کرد.

روش انجام IVF در درمان ناباروری

تخمک گذاری زیاد (Superovulation)

در زنان، تخمدان به طور معمول در هر چرخه یک تخمک منحصر به فرد تولید می کند. برای اینکه روی بیش از یک تخمک برای انجام IVF حساب کنیم، لازم است تخمک گذاری زیاد صورت گیرد. این روش شامل تحریک هورمونی تخمدان با گنادوتروپین های اگزوژن برای تولید بیشتر تخمک در هر سیکل جنسی است. تخمک هایی که در این حالت به دست می‌آیند معمولاً نابالغ هستند و به زمان بلوغ آزمایشگاهی نیاز دارند. در موش‌ها، تخمک‌گذاری، توسط تزریق‌های متوالی گنادوتروپین جفتی اسب (eCG) و گنادوتروپین جفتی انسان (hCG) انجام می‌شود. به طور خلاصه در موش های ماده ۲۱ تا ۲۷ روزه (C57BL/6J) یا ۱۸ تا ۲۵ روزه (BTBR) با تزریق داخل صفاقی ۵ واحد بین المللی (IU) گنادوتروپین سرم مادیان باردار (PMSG) و به دنبال آن ۵ واحد بین المللی گنادوتروپین کوریونی انسانی (hCG)، و تزریق NHPP تا ۴۸ ساعت بعد، صورت می گیرد.

آماده سازی نمونه اسپرم

برای این کار لازم است طبق اصول اخلاقی کار با حیوان، اسپرم ها، از اپیدیدیم موش های نر بالغ جدا شده و محتویات آن در محیط M2 برای آزمایش‌های ICSI، یا در محیط HTF که با ۱% BSA غنی شده، برای آزمایش‌های IVF نگهداری شود. برای آماده سازی اسپرم برای آزمایش های IVF، نمونه ها به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور با ۵درصد CO۲ و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه می شود.

مراحل انجام IVF

ظروف نمونه طبق روال زیر آماده می شود:

  1. ظرف اسپرم: داخل پلیت مخصوص، قطره ۱۰۰ لاندایی حاوی محیط کشت ریخته شده و ۳۰ دقیقه قبل از جمع آوری اسپرم، روی آن را با روغن مخصوص پوشانده و در دمای انکوباتور نگهداری شود.
  2. ظرف لقاح: داخل پلیت مخصوص، قطره ۲۰۰ لاندایی حاوی محیط کشت ریخته شده و ۱۰ دقیقه قبل از جمع آوری تخمک، روی آن را با روغن مخصوص پوشانده و در دمای انکوباتور نگهداری شود.
لقاح آزمایشگاهی IVF
  • ظرف شستشو

۴ قطره (۸۰μL / قطره) mHTF را در ظرفی ریخته و روی آنها را با پارافین می پوشانیم. ظرف را به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور قرار می دهیم.

لقاح آزمایشگاهی IVF

جمع آوری اسپرماتوزوا

۱ یا ۲ موش نر بالغ (۳ تا ۶ ماهه) را طبق اصول اخلاق قربانی کرده و اپیدیدیم های آنها را برداشته و در ظرف اسپرم نگهداری می کنیم. مجرای هر اپیدیدیم را با استفاده از یک جفت قیچی ریز برش داده، سپس با استفاده از یک سوزن تشریح، سطح اپیدیدیم را به آرامی فشار تا اسپرم درون آن آزاد شود.

لقاح آزمایشگاهی IVF

جمع آوری تخمک ها

تقریباً ۱۷-۱۵ ساعت پس از تجویز hCG، یک موش ماده در حال تخمک گذاری را قربانی کرده و فقط لوله های تخمک (آمپول) را برداشته و در پارافین مایع موجود در ظرف لقاح غوطه ور می کنیم.

لقاح آزمایشگاهی IVF

ظرف لقاح شامل COCها را قبل از تلقیح به مدت ۳۰ تا ۶۰ دقیقه در انکوباتور نگهداری می کنیم.

حدود ۶ لاندا از محیط حاوی اسپرم را به پلیت تلقیح انتقال داده و با استفاده از قطرات شستشو چند مرتبه آن را شستشو می دهیم. ۶ ساعت پس از تلقیح، تخمک ها در قطره سوم mHTF قابل مشاهده هستند.

پس از کشت یک شبه تخمک، جنین های مرحله ۲ سلولی به دست آمده را تنها به قطره چهارم mHTF در ظرف شستشو منتقل می کنیم. این جنین‌ها را می‌توان منجمد کرد یا به موش های ماده‌ دریافت‌کننده منتقل نمود و یا تا مرحله بلاستوسیست کشت داد.

لقاح آزمایشگاهی IVF

آموزش ویدئویی تکنیک IVF

مطالب مرتبط: ایجاد مدل آزواسپرمی – ایجاد مدل سندرم تخمدان پلی کیستیک (PCO)
خدمات مرتبط: پژوهش و مطالعه بروی حیوانات آزمایشگاهی – ایجاد انواع مدل های حیوانی

نمایش بیشتر

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

4 × 2 =

دکمه بازگشت به بالا