آموزش جامع رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو (Toluidine Blue) در آزمایشگاه بافت‌شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه‌ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو در بافت‌شناسی

تولوئیدین بلو (Toluidine Blue; TBO) همچنین به عنوان کلرید تولونیوم (Tolonium Chloride) شناخته می شود یک رنگ متاکروماتیک اسیدوفیل است که به صورت انتخابی اجزای بافت اسیدی (سولفات‌ها، کربوکسیلات‌ها و رادیکال‌های فسفات) را رنگ می‌کند. همچنین به عنوان متیل آنالین یا آمینوتولوئن شناخته می شود، اساسا دارای ۳ ایزوفرم به نام های ارتوتولویدین، پاراتولوئیدین و متاتولوئیدین است. رنگ تولوئیدین بلو (TBO) میل ترکیبی به اسیدهای نوکلئیک دارد و بنابراین به محتویات هسته‌ای بافت‌هایی با محتوای DNA و RNA بالا متصل می شود. این رنگ یکی از اعضای گروه تیازین (thiazine) است و تا حدی در آب و الکل محلول است. رنگ آمیزی تولوئیدین بلو بر اساس اصل متاکرومازی، بافت ها را رنگ می‌کند. رنگ با بافت‌ها واکنش می دهد تا رنگ متفاوتی از رنگ اصلی و از بقیه بافت تولید کند.

تاریخچه رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو

رنگ آمیزی تولوئیدین آبی از زمان کشف آن توسط ویلیام هنری پرکین (William Henry Perkin)در سال ۱۸۵۶ برای کاربردهای مختلف پزشکی شناخته شد و پس از آن عمدتاً توسط صنعت رنگ استفاده شد. رنگ آمیزی حیاتی (Vital Staining) رنگ آمیزی سلول ها یا بافت ها در حالت زنده است. اولین تکنیک توسعه یافته توسط پل ارلیش در سال ۱۸۸۵ شامل غوطه وری بافت تازه برداشته شده در آبی متیله بود. Neibel و Chomet و Shedd اولین محققانی بودند که کاربرد حیاتی تولوئیدین بلو را برای تشخیص ضایعات پیش بدخیم و بدخیم حفره دهان گزارش کردند. آنها خاصیت رنگ TBO را برای تأیید ضایعات مشکوک بالینی به عنوان نئوپلاستیک، تعیین حاشیه رشد پیش بدخیم و بدخیم و تشخیص تومورها تأیید کردند.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو در بافت شناسی

رنگ آمیزی تولوئیدین بلو به طور گسترده به عنوان یک رنگ حیاتی برای ضایعات مخاطی مورد استفاده قرار گرفته است و همچنین به دلیل خاصیت متاکروماتیک آن در بخش های بافتی برای رنگ آمیزی خاص اجزای خاص کاربرد دارد. تولوئیدین بلو در داخل بدن برای شناسایی دیسپلازی و کارسینوم حفره دهان استفاده شده است. استفاده از آن در داخل بدن مبتنی بر این واقعیت است که سلول‌های دیسپلاستیک و نئوپلاستیک ممکن است از نظر کمی اسیدهای نوکلئیک بیشتری نسبت به بافت‌های طبیعی داشته باشند. همچنین اپیتلیوم بدخیم احتمال دارد حاوی کانال‌های داخل سلولی باشد که پهن‌تر از اپیتلیوم طبیعی هستند و نفوذ رنگ را تسهیل می‌کند. استفاده از تولوئیدین بلو در مقاطع بافتی با هدف مشخص کردن اجزایی مانند گرانول‌های ماست سل (به دلیل وجود هپارین و هیستامین)، موسین و غضروف نیز انجام می‌شود. در باکتری شناسی، کورنی باکتریوم دیفتری (Corynebacterium diphtheriae) حاوی گرانول هایی با پلی فسفات معدنی پلیمریزه شده است که با تولوئیدین بلو بنفش یا قرمز را رنگ می کند. رنگ تولوئیدین توسط جراحان برای کمک به متمایز نمودن نواحی دیسپلازی مخاط از بافت طبیعی استفاده می شود. از این تکنیک رنگ آمیزی برای انتخاب بهترین محل ضایعه در حین جراحی و برداشتن آن کمک می‌کند.

نگاهی اجمالی به ماست‌سل‌های رنگ شده با تولوئیدین بلو

ماست سل ها نوعی گلبول سفید که در بافت‌های همبند در سراسر بدن، به ویژه زیر پوست، نزدیک رگ‌های خونی و رگ‌های لنفاوی، در اعصاب، در ریه‌ها و روده‌ها یافت می‌شود. ماست سل ها نقش مهمی در نحوه واکنش سیستم ایمنی به باکتری ها و انگل های خاص دارند و به کنترل انواع دیگر پاسخ های ایمنی کمک می‌کنند. آنها حاوی مواد شیمیایی مانند هیستامین، هپارین، سیتوکین ها و فاکتورهای رشد هستند. آنها این مواد شیمیایی را در طی واکنش‌های آلرژیک و برخی پاسخ های ایمنی آزاد می‌کنند. این مواد شیمیایی اثرات زیادی از جمله گشاد شدن عروق خونی و رگ زایی دارند. در طی یک پاسخ آلرژیک، آنها می توانند باعث گرگرفتگی و خارش شوند. در مقادیر زیاد نیز می توانند باعث گرفتگی شکم، درد عضلانی، حالت تهوع، استفراغ، اسهال، فشار خون پایین و شوک شوند. ماست‌سل ها برای اولین بار به دلیل ویژگی متاکرومازی در سال ۱۸۷۷ توسط Paul Ehrlich شناسایی شدند. ترکیب مسئول متاکرومازی به عنوان هپارین، یک هتروگلیکان غنی از استرهای نیمه سولفات می‌باشد که در پاتولوژی مورد هدف رنگ آمیزی تولوئیدین بلو قرار می‌گیرد.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو

انواع بافت های بدن موجود زنده که در ساختارشان از بافت‌های همبند، موسین‌ها، مواد پایه‌ای غضروف، گرانول‌های ماست سل و بسیاری از موسین‌های اپیتلیال کاربرد دارد، می‌توانند کاندیدای مطالعه با رنگ آمیزی تولوئیدین بلو باشند. از جمله این بافت ها می‌توان به بافت پوششی دهان، پوست، چشم، مفصل، استخوان، تیموس و غیره اشاره نمود.

در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو می‌پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو در بافت شناسی

رنگ تولوئیدین بلو بر اساس اصل متاکرومازی (ویژگی برخی رنگ ها که یک بافت را با چندین رنگ مختلف رنگ می کند)، بافت ها را رنگ آمیزی می کند. رنگ با بافت ها واکنش می دهد تا رنگی متفاوت از رنگ اصلی و بقیه بافت ایجاد کند. متاکرومازی یا متاکروماسی در سال ۱۸۷۵ توسط کورنیل، یورگنس و رانویر کشف شد. متاکرومازی بصورت انتخابی، فقط ساختارهای بافتی خاصی را رنگ می‌کنند. پدیده ای است که در آن رنگ ممکن است بسته به غلظت و محیط اطراف خود نور را در طول موج های مختلف جذب کند و این توانایی را دارد که بدون تغییر در ساختار شیمیایی خود رنگ خود را تغییر دهد. تغییرات فیزیکی که باعث این تغییر رنگ می شود، شکل تخصصی و منظمی از تجمع رنگ است. برای ایجاد متاکرومازی باید گروه های الکترونگاتیو آزاد در سطح بافت ها وجود داشته باشد. به عنوان مثال، متیلن بلو ، تولوئیدین آبی، سافرانین از رنگ‌های متاکروماتیک هستند که قادر به رنگ آمیزی بافت‌ها با رنگ‌هایی متفاوت از خود رنگ است.

جهت تهیه محلول تولوئیدین بلو، یک گرم از پودر رنگ را در ۱۰۰ سی سی از اتانول ۷۰ درصد حل نموده و پس از حل شدن کامل در ظرف شیشه‌ای تیره نگهداری می‌کنیم. از این رنگ تهیه شده برای رنگ آمیزی نمونه های بافتی به دو روش استفاده می‌شود که یک روش رنگ آمیزی سلول و بافت های زنده هستند و روش دوم مطالعه و بررسی نمونه های بافتی جدا شده از موجود و فیکس شده می‌باشد که در این پروتکل، به روش دوم با ذکر جزئیات بیشتر می‌پردازیم.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو

1. پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت­ها را در فرمالین ده درصد یا به صورت فریز شده فیکس می­کنیم.
   
2. در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت­ها قرارداده و نام یا کد نمونه­ ها را روی تیشو بسکت­‌ها می نویسیم.
   
3. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌­های بافتی را حذف نموده، بنابراین از غلظت­‌های افزایشی اتانول استفاده می­شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می­گردد.
   
4. قالب­گیری بافت: بلوک­‌های پارافینی از نمونه‌­های بافتی با پارافین جامد و طبق دستورالعمل‌­های دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ تهیه می کنیم.
   
5. برش‌­گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌­گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش­های نازک در حد ۵ الی ۱۰ میکرومتر آماده می کنیم.
   
6. بعد از تهیه لام از سکشن های بافتی و حذف پارافین اضافی نمونه ها، لام ها را با غلظت های کاهشی اتانول آبدهی می کنیم.
   
7. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ ­آمیزی رنگ می­کنیم.

مراحل رنگ‌آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو

1. اولین مرحله، تهیه محلول working solution تولوئیدین بلو با pH: 2-2.5 است. ۵ سی سی از استوک اصلی رنگ را با ۴۵ سی سی سدیم کلراید یک درصد میکس کرده pH محلول می بایست حدودا ۲.۳ و کمتر از ۲.۵ باشد.
   
2. برش­های نمونه های بافتی را در جار رنگ آمیزی حاوی محلول working solution به مدت ۲-۳ دقیقه انکوبه می کنیم  و سپس نمونه ها را ۳ مرتبه با آب مقطر شستشو می­دهیم.
   
3. نمونه های بافتی رنگ شده را با اتانول ۹۵% و دو مرتبه با اتانول ۱۰۰ درصد سریعا دهیدراته می­کنیم.
   
4. در این مرحله دو مرتبه ( هر بار ۳ دقیقه) عمل شفاف­ سازی نمونه‌­های بافتی را با انکوبه در زایلین انجام می­دهیم.
   
5. لام ها را با لامل و چسب انتلان مونت نموده و نهایتا پس از اتمام مراحل رنگ­‌آمیزی تولوئیدین بلو، لام­های آماده شده را با میکروسکوپ نوری بررسی می­کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی تولوئیدین بلو

مواد مورد نیاز

• پودر رنگ تولوئیدین بلو
• فرمالین
• آب مقطر
• سدیم کلراید یک درصد
• زایلین
• اتانول
• چسب انتلان

تجهیزات مورد نیاز

• میکروسکوپ نوری
• جار رنگ ­آمیزی لام
• لام و لامل
• میکروتوم
• پارافین دیسپنسر
• تیشو امبدینگ
• تیشوبسکت

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی تولوئیدین بلو

همانطور که در بخش های قبل توضیح داده شد یکی از کاربردهای رنگ‌­آمیزی تولوئیدین بلو، رنگ نمودن بافت های زنده است. هنگامی که در پاتولوژی هدف مطالعه بخش های مختلف بافت زنده در بدن موجود زنده است می بایست از موادی استفاده گردد که به سلول آسیبی وارد نکند، به همین علت به این مواد رنگ­‌های حیاتی می­گویند. نکته حائز اهمیت و مهم در  این پروتکل استفاده از محلول رنگی تازه است و استفاده از محلول رنگی مانده نتایج اشتباه را به دنبال دارد.

ماست سل ها در بافت همبند یافت می شوند و سیتوپلاسم آنها حاوی گرانول‌هایی (متاکروماتیک) متشکل از هپارین و هیستامین است. تولوئیدین آبی باید ماست‌سل‌ها را به رنگ قرمز-بنفش (رنگ آمیزی متاکروماتیک) و پس زمینه آبی (رنگ-آمیزی ارتوکروماتیک) رنگ کند. متاکرومازی، رنگ آمیزی عناصر بافتی با رنگ متفاوت از محلول رنگ، به دلیل pH، غلظت رنگ و دمای رنگ پایه است. رنگ‌های آبی یا بنفش تغییر رنگ قرمز و رنگ‌های قرمز تغییر رنگ زرد با عناصر بافت متاکروماتیک را نشان می‌دهند.

ارائه خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو در آزمایشگاه بافت شناسی

بافت شناسی، سیتولوژی و سایر رشته های علمی مرتبط به مطالعه آناتومی میکروسکوپی بافت ها و سلول ها می پردازند. برای دستیابی به ساختار بافتی و سلولی معتبر و استاندارد، نمونه‌ها باید به روش صحیح رنگ‌آمیزی شوند. یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه‌های بافتی، رنگ آمیزی اختصاصی انواع الاستین در بافت های موجود زنده از جمله حیوان آزمایشگاهی به نام رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو است.
در آزمایشگاه بافت شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، برش‌های میکرونی از نمونه‌های بافتی مختلف، تهیه و با تکنیک های رنگ آمیزی عمومی و اختصاصی از جمله خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی تولوئیدین بلو رنگ نموده و نهایتا به بررسی و مطالعه نمونه بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح‌های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.

جمع بندی

تولوئیدین بلو (TB) عضوی از گروه رنگ‌های متاکروماتیک تیازین است و تا حدی هم در آب و هم در اتانول قابلیت حل شدن را دارد. رنگ TB به عنوان یک رنگ حیاتی برای مشخص کردن ضایعات بالقوه بدخیم دهان استفاده شده است و ممکن است ضایعات اولیه را که ممکن است در معاینه بالینی نادیده گرفته شوند، شناسایی کند. تولوئیدین بلو در داخل بدن برای شناسایی دیسپلازی و کارسینوم حفره دهان استفاده شده است. استفاده از تولویدین بلو در مقاطع بافتی با هدف برجسته کردن اجزایی مانند گرانول های ماست سل، موسین و غضروف انجام می شود.

سوالات متداول

❔ کدام ویژگی رنگ تولوئیدین بلو (Toluidine Blue)، کاربرد آن را حائز اهمیت کرده است؟
✔️ ویژگی متاکرومازی رنگ آمیزی تولوئیدین بلو در بافت شناسی سبب پرکاربرد شدن این تکنیک شده است.

❔ کدام نمونه های بافتی مورد مطالعه با رنگ آمیزی تولوئیدین بلو قرار می گیرد؟
✔️ انواع نمونه های بافتی سالم و توموری از انسان و حیوانات آزمایشگاهی مانند کبد، کلیه، قلب، طحال و غیره با رنگ آمیزی تولوئیدین بلو بررسی می شود.