آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین (Safranin-O) در آزمایشگاه بافت شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه ای از رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین در بافت شناسی

سافرانین (Safranin O یا Basic red 2) یک رنگ بیولوژیکی است که در بافت شناسی و سیتولوژی استفاده می‌شود. سافرانین‌ها ترکیبات آزونیوم ۲،۸-دی متیل-۳،۷-دیامینوفنازین متقارن هستند. آنها از اکسیداسیون مشترک یک مولکول پارادیامین (para-diamine) با دو مولکول یک آمین اولیه به دست می‌آیند. آنها جامدات کریستالی هستند که درخشش فلزی سبز مشخصی را نشان می‌دهند و به راحتی در آب حل می‌شوند و به رنگ قرمز یا بنفش هستند. سافرانین‌ها بازهای قوی هستند و نمک‌های موناسید (monacid) پایدار را تشکیل می دهند. محلول الکلی آنها فلورسانس زرد مایل به قرمز را نشان می دهد. وزن مولکولی آن ۳۵۰.۸ گرم بر مول است. سافرانین حلالیت قوی در الکل و ضعیفی در آب دارد. در این مقاله قصد داریم به پروتکل رنگ‌آمیزی سافرانین و کاربردهای آن بپردازیم.

انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین در بافت شناسی

سافرانین به عنوان یک رنگ اضافی در برخی از پروتکل های رنگ آمیزی، برای رنگ‌آمیزی هسته سلول‌ها استفاده می شود. علاوه براین سافرانین به عنوان رنگ اضافی هم در رنگ آمیزی گرم و هم در رنگ آمیزی اندوسپور کاربرد دارد. با استفاده از رنگ آمیزی سافرانین می‌توان باکتری‌های گرم منفی را به راحتی از باکتری‌های گرم مثبت تشخیص داد. همچنین می توان از آن برای تشخیص غضروف، موسین و گرانول‌های ماست‌سل استفاده کرد.
در تحقیقات پزشکی برای رنگ‌آمیزی پروتئوگلیکان اسیدی که در بافت‌های غضروف یافت می‌شود و در انواع بیماری‌های مفصلی و استئوآرتریت (Osteoarthritis) مورد استفاده قرار می گیرد و محققان را قادر می‌سازد نحوه غضروف‌زایی سلولی را در بافت های مختلف تجزیه و تحلیل کنند.

نگاهی اجمالی به گلیکوزآمینوگلیکان رنگ شده با سافرانین

گلیکوزامینوگلیکان ها (GAGs) کربوهیدرات های پیچیده‌ای هستند که در همه جا و به وفور در سطح سلول و در ماتریکس خارج سلولی (ECM) یافت می‌شوند. تنوع ساختاری خارق‌العاده GAG ها آنها را قادر می سازد تا با طیف وسیعی از مولکول‌های بیولوژیکی تعامل داشته باشند. از طریق این فعل و انفعالات، GAGها فرآیندهای بیولوژیکی مختلفی مانند چسبندگی سلولی، تکثیر و مهاجرت، مونتاژ ECM، ترمیم بافت، انعقاد، پاسخ‌های ایمنی و بسیاری دیگر را تعدیل می‌کنند. بر اساس تفاوت واحدهای دی ساکارید تکراری در ساختار GAG ها، آنها را می‌توان به چهار گروه اصلی دسته‌بندی کرد: هپارین/هپاران سولفات، کندرویتین سولفات/درماتان سولفات، کراتان سولفات و هیالورونان. GAG ها عملکردهای بیولوژیکی مختلفی را انجام می‌دهند و نقش مهمی در تعدادی از بیماری های مختلف ایفا می‌کنند. GAGها فعالیت‌های متعددی را در ECM برای تنظیم خواص مکانیکی بافت ایفا می‌کنند: تکثیر سلولی، چسبندگی سلولی، سیگنال‌دهی فاکتور رشد، عملکرد سلول‌های ایمنی و ساختار کلاژن. تنوع ساختاری و عملکردی GAG ها توسط ترکیب قندی GAG، اندازه زنجیره‌های GAG، میزان سولفاته شدن و توانایی اتصال کلاژن و سایر پروتئین ها تنظیم می‌شود.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی سافرانین

هر نمونه بافتی که برای مطالعه گلیکوزآمینوگلیکان، غضروف، موسین و ماست سل‌ها مورد هدف است را می توان با سافرانین رنگ نمود. از جمله بافت ها عبارتند از: بافت های غضروفی، بافت های مفصلی، بافت پیوندی، مغز استخوان و غیره.

در این مقاله به یکی از پروتکل­های ستاپ شده رنگ­ آمیزی اختصاصی سافرانین می­پردازیم.

پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین در بافت‌شناسی

در این پروتکل می بایست، قبل از رنگ آمیزی چند محلول بصورت تازه تهیه کنیم. با حل کردن یک گرم از محلول هماتوکسیلین در ۱۰۰ سی سی اتانول ۹۵% محلول ۱ و با اضافه کردن ۴ سی سی فریک کلراید ۲۹% و یک سی سی هیدروکلریک اسید در ۹۵ سی سی آب مقطر محلول ۲ را تهیه میکنیم. حجم برابر از این دو محلول ۱ و ۲ را با هم برای محلول Weigert’s Iron Hematoxylin Working Solution میکس می‌کنیم.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین

1. پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت‌ها را در فرمالین ده درصد فیکس می‌کنیم.
   
2. در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت‌ها قرارداده و نام یا کد نمونه‌ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
   
3. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه٬های بافتی را حذف نموده، بنابراین با غلظت‌های افزایشی اتانول این مرحله انجام می‌شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
   
4. قالب‌گیری بافت: بلوک‌های پارافینی از نمونه‌های بافتی با استفاده از دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ و پارافین جامد انجام می‌دهیم.
   
5. برش‍‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۵ الی ۲۰ میکرومتر تهیه می‌کنیم.
   
6. آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرم کن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
   
7. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین

1. لام های آماده شده را به مدت ده دقیقه در جار رنگ‌آمیزی حاوی محلول Weigert’s Iron Hematoxylin Working Solution انکوبه می کنیم و سپس ده دقیقه با آب شستشو می دهیم.
   
2. نمونه ها را با محلول Fast green 0.05% (0.5 گرم در ۱۰۰۰ سی سی آب مقطر) ۵ دقیقه رنگ می کنیم.
   
3. با محلول استیک اسید ۱% کمتر از ۱۰ الی ۱۵ ثانیه لامها را تیمار می کنیم.
   
4. اکنون لام‌ها را ۵ دقیقه با محلول رنگ سافرانین o 0.1% رنگ می‌کنیم.
   
5. نهایتا لام ها را با الکل ۹۵ درصد، اتانول مطلق و زایلن (هر کدام دو مرتبه و هر بار ۲ دقیقه) آبگیری و پاکسازی می‌کنیم. پس از خشک شدن لام ها، با چسب انتلان مونت کرده و با میکروسکوب نوری نمونه های رنگ شده را مطالعه و آنالیز می کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی سافرانین

مواد مورد نیاز

• اتانول مطلق
• پارافین
• آب مقطر
• فرمالین ده درصد
• چسب انتلان
• هماتوکسیلین
• فریک کلراید
• هیدروکلریک اسید
• محلول Fast green 0.05%
• استیک اسید
• سافرانین
• زایلن

تجهیزات مورد نیاز

• میکروسکوپ نوری
• دستگاه میکروتوم
• دستگاه گرمکن اسلاید بافتی
• دستگاه پارافین دیسپنسر 
• دستگاه تیشو­امبدینگ
• جار رنگ ­آمیزی لام
• لام و لامل

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ آمیزی سافرانین

در بررسی و مطالعه غضروف مفصلی معمولاً از رنگ‌آمیزی‌هایی مانند سافرانین O و فست گرین (برای گلیکوزآمینوگلیکان ها)، آلشین بلو (برای پروتئوگلیکان‌ها) و پریودیک اسید-شیف (برای کندرویتین سولفات و گلیکوپروتئین-ها) استفاده می‌شود. رنگ سافرانین با اتصال به پروتئوگلیکان‌های اسیدی در بافت غضروف با میل ترکیبی بالا و تشکیل یک کمپلکس قرمز عمل می‌کند.

نتیجه رنگ آمیزی سافرانین در بافت های غضروفی بدین صورت است: هسته سلول‌ها سیاه، سیتوپلاسم سبز آبی و غضروف، موسین، گرانولهای ماست سل طیف رنگی نارنجی تا قرمز. در تحقیقات بافت شناسی برای مطالعه چگونگی و نحوه تشکیل غضروف در بافت ها در اثر تیمار و درمان با ماده شیمیایی یا دارو از تکنیک رنگ آمیزی سافرانین به عنوان تکنیکی به صرفه و مطمئن استفاده می کنند. به عنوان مثال محققان اثر درمانی امواج اولتراسوند پالس با شدت کم را بر روند بهبودی اتصال استخوان به تاندون در مدل القایی التهاب در خرگوش، با رنگ آمیزی سافرانین مطالعه کردند. با بهبود در طول زمان، بافت غضروف مانند بیشتری در محل اتصال استخوان به تاندون یافت شد.

ارائه خدمات رنگ آمیزی اختصاصی سافرانین در آزمایشگاه بافت شناسی

انواع روش‌های رنگ‌آمیزی از تکنیک های رایج در آزمایشگاه بافت شناسی است و برای ایجاد تمایز بین اجزای مختلف بافت‌ها و سلول ها جهت آنالیز دقیق نمونه ها استفاده می‌گردد. یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه‌های بافتی، مایعات بدن و سلولهای مختلف، رنگ‌آمیزی اختصاصی سافرانین است.
در آزمایشگاه بافت شناسی شرکت دانش بنیان بافت و ژن پاسارگاد، می توانید به دیتاهای معتبر و آنالیز نمونه های بافتی با تکنیک های رنگ آمیزی در کوتاه ترین زمان ممکن دست یابید. چرا که این آزمایشگاه با به کارگیری تجهیزات و مواد آزمایشگاهی باکیفیت و استاندارد، انواع تکنیک ها را ستاپ کرده تا سریعا نتایج مورد قبول طرح های پژوهشی حاصل گردد.

جمع بندی

رنگ لیپوفیلیک سافرانین یکی از امیدوارکننده‌ترین رنگ‌های آزمایشگاه بافت شناسی است که برای تحقیقات و تشخیص پزشکی هیستوپاتولوژی و سیتولوژی استفاده می‌شود. برای تشخیص هر گونه تغییر در بیماری مفصلی و O به عنوان یک نشانگر برای کاهش گلیکوزامینوگلیکان در استئوآرتریت استفاده می شود و همچنین مقدار پروتئوگلیکان موجود در غضروف را تشخیص می دهد. سافرانین استفاده می شود.

سوالات متداول

❔ رنگ سافرانین O چگونه کار می کند؟
✔️ رنگ سافرانین با اتصال به پروتئوگلیکان های اسیدی در بافت غضروف با میل ترکیبی بالا و تشکیل یک کمپلکس نارنجی مایل به قرمز عمل می کند.

❔ سافرانین O برای چه مواردی استفاده می شود؟
✔️ سافرانین به عنوان رنگ اضافی در برخی از پروتکل های رنگ آمیزی، هسته سلول ها را قرمز رنگ می کند. همچنین برای رنگ آمیزی غضروف و موسین در نمونه های بافتی کاربرد دارد.