دستورالعمل جامع عیب و رفع اشکال خطاهای تست الایزا
رایج ترین خطاهای تست الایزا و راه حل های آنها
کاهش خطاهای الایزا یکی از مهم ترین مواردی ست که در حین انجام تست الایزا و نتیجه گیری صحیح در پژوهش ها باید در نظر گرفت. در صورتی که دقت کافی در هر یک از مراحل آن صورت نگیرد ممکن است منجر به نتایج اشتباه در تست های آزمایشگاهی هورمونی و نهایتا خطا در نتیجه گیری پژوهش ایجاد نماید. در ادامه به مشکلاتی که در حین آزمایش ممکن است رخ دهد و همچنین راه حل های جلوگیری از این خطاها می پردازیم.
تست الایزا یکی تست های پر اهمیت در آزمایشگاه پاتولوژی و بافت شناسی میباشد که جهت بررسی پروتئین ها ب کار میرود. از این تست برای مطالعات پژوهشی و همچنین تشخیصی استفاده میگردد. به همین جهت، حصول اطمینان از صحت نتایج اهمیت بسزایی دارد.
چگونه متوجه خطاهای الایزا شویم:
چهار مرحله کلی برای الایزا وجود دارد. این مراحل عبارتند از :
- پوشش یا کوت کردن چاهک های الایزا با آنتی ژن یا آنتی بادی (coating)
- مسدود کردن با Blocking buffer (معمولاً با افزودن آلبومین سرم گاوی [BSA])
- تشخیص، ردیابی یا detection
- خواندن نهایی (Final reading)
هر یک از مراحل ذکر شده نیاز به دقت هایی دارد که عدم رعایت هر کدام از آنها می تواند موجب خطا در نتایج تست الایزا گردد.
نکات مهم در شکل گیری خطاهای الایزا
به طور کلی برخی از عوامل مهمی که باعث خطاهای الایزا در طول مراحل آزمایش که از خطاهای انسانی یا تکنیکی نشاًت می گیرند و منجربه ایجاد خوانش نادرست و نتایج اشتباه گردند می توان به موارد زیر اشاره کرد :
- کیفیت نمونه و احتمال آلودگی آن
- اشکال در مرحله پوشش دهی آنتی ژن یا آنتی بادی
- خطا در چیدمان و ریختن نمونه ها
- عدم توجه به دمای نگهداری کیت یا زمان انجام آزمایش ( عدم رعایت دمای انکوباسیون )
- خطای سمپلینگ و یا حتی کالیبره نبودن سمپلر
- شستشوهای کم و یا بیش از حد چاهک ها
- خشک شدن میکروپلیت پس از شستشو
- تشخیص اشتباه سیگنال یا جذب نوری دستگاه الایزاریدر ( کالیبره نبودن دستگاه خوانشگر )
- اشکال در مرحله رقیق سازی محلول ها
- عدم رعایت زمان انکوباسیون
- وجود ذرات غیر قابل تشخیص در محلول ها یا چاهک
در صورت داشتن هر گونه سوال جهت مشاوره رایگان تماس بگیرید
۰۲۱۶۶۱۲۱۹۷۶
کیفیت نمونه های آنالیز
کیفیت نمونه، می تواند اثر بسیار زیادی در نتایج نهایی داشته باشد. آلودگی با قارچ یا باکتری تاثیر مستقیم روی آنتی بادی در الایزا می گذارد. از طرفی شرایط نگهداری نمونه بسیار قابل اهمیت و جزء خطاهای رایج در الایزا می باشد.
- حداکثر زمان مجاز برای نگه داری خون کامل در دمای ۳۷ درجه، ۵ دقیقه می باشد. زمان طولانی تر باعث تخریب ساختار پروتئینی، آزاد سازی برخی از فاکتورهای سرمی و افزایش بیان کاذب می گردد.
- برای الایزا از نمونه های سرمی لیز شده نباید استفاده شود.(به دلیل تداخل رنگی)
- از ذوب و انجماد نمونه پرهیز شود و برای استفاده طولانی مدت نمونه داخل فریز -۸۰ ذخیره گردد.
آماده سازی و کنترل کیت
پس از تهیه کیت به دستوالعمل دقیق کیت مراجعه شده و پس از بررسی تاریخ انقضای درج شده روی آن و سری ساخت محصول فقط یک شخص تمام مراحل کار را در روند آزمایش انجام دهد تا به دنبال آن خطاهای رایج در الایزا کاهش یابد. نکات زیر در مورد بررسی کیت باید رعایت گردد:
- در آماده سازی کیت دقت شود از تکان بیش از اندازه محلول ها و تولید کف جلوگیری شود.
- تاکید می شود که از محلول ها موجود درکیت های مختلف، خصوصا با سری ساخت متفاوت استفاده نشود.
- با توجه به نوع کار به حساسیت کیت دقت شود و در صورت پایین بودن دقت آن از کیت هایی با برند متفاوت استفاده گردد.
- اجزاء کیت قبل از استفاده باید به دمای محیط رسیده باشد، در دمای پایین به دلیل کاهش واکنش آنزیمی، جذب های غیر یکنواخت بوجود خواهد آمد.
- کنترل آلودگی محلول ها: اسیدی یا قلیائی شدن بافر (به دلیل آلودگی قارچی یا باکتریال) منجر به افزایش یا کاهش کاذب جذب می گردد . شرایط نامناسب نگهداری نمونه و استفاده از تجهیزات غیر استریل منجر به آلودگی خواهد شد.
- کنترل درب محلول ها از نکات مهم در جلوگیری از بروز خطای تست های الایزایی ست. باز بودن درب محلول ها منجر به تبخیر و نهایتا تولید پس زمینه پررنگ تر از حد انتظار می گردد. به طور مثال افزایش غلظت کنژوگه کیت الایزا و یا محلول های استاندارد در این حالت خطای زیادی را ایجاد خواهد کرد.
بررسی خطاهای انسانی در مراحل انجام تست الایزا
بدون تردید یکی از عوامل مشکل ساز حین انجام تمام تکنیک های آزمایشگاهی و خطاهای رایج در الایزا خطاهای انسانی اپراتور می باشد. به همین دلیل توصیه می شود از کارشناسان با تجربه و متخصص در هر قسمت استفاده شود. تعدادی از خطاهای انسانی قابل انتظار و شرایط رفع آن را بررسی خواهیم کرد:
- عدم وجود تمرکز کافی کارشناس و خطا در چیدمان و ریختن نمونه یکی از این خطاهای انسانی ست. به همین منظور لازم است ترتیب ریختن محلول در چاهک ها طبق الگوش چیدمان که از قبل مشخص شده باشد و بدین طریق کاهش خطا در الایزا و الگوی چیدمان اتفاق بیافتد.
- · توجه شود که حین شستشو ول های کار نشده از پلیت خارج شود.
- دمای بالای محیط حین انجام کار، منجر به افزایش جذب نمونه می گردد.
- عدم تکان دادن پلیت(حداقل ۲۰ ثانیه) پس از اضافه نمودن محلول اسیدی توقف دهنده واکنش منجر به عدم واکنش مناسب و خطا در خوانش نمونه می شود.
- از تشکیل حباب حین کار ممانعت شود. ایجاد حباب هوا در چاهک های پلیت مانع تماس کامل کنژوکه و نمونه شده و منجربه اشکالاتی در جذب نوری دستگاه می شود.
- پس از اتمام کار کف پلیت پاک شود و از ایجاد خراش در کف پلیت جلوگیری شود. این کار باعث کاهش خطا در الایزا می شود. وجود آلودگی و خراش با توجه به تابش از بالا به پایین دستگاه میکروپلیت ریدر این آلودگی در خوانش تاثیر گذار است.
- بدون تردید خطای سمپلینگ، شایع ترین خطای موجد در الایزا است و رعایت چند نکته که در ادامه خواهد آمد باعث کاهش خطا در الایزا و تکرار پذیری و صحت آزمایشات به مقدار قابل توجهی افزایش یابد.
- در برداشتن نمونه باید از روش استاندارد استفاده نمود. یعنی برای کشیدن محلول دکمه سمپلر را تا مرحله اول فشار داده و برای تخلیه، آن را تا انتها فشار دهید. اگر برای برداشتن و یا تخلیه مسیر معکوس را انجام دهید، حجم محلول به هنگام برداشت و تخلیه بیشتر و یا کمتر از حد قابل قبول می گردد.
- استفاده از سرسپلر مناسب در دقت حجم نمونه، بسیار تاثیر گذار می باشد و حتما از سرسمپلر های مرغوب استفاده شود.
- برای برداشتن حجم کم، سرسمپلر را بین ۲ تا ۵ میلیمتر در محلول وارد کنید. فرو بردن بیش از حد باعث آغشته شدن بالای سرسمپلر و تشکیل حباب می گردد. برای برداشتن حجم بالا سر سپلر را تا ۱۰ میلی متری هم می توان داخل محلول وارد کنید.
- عمود نگه داشتن سمپلر یکی از خطاهای رایج سمپلینگ است. توجه شود زاویه بیش از ۲۰ درجه از حالت عمود برای برداشتن محلول، منجر به خطا خواهد شد.
- سر سپلر را حتما از کنار ظرف فاصله دهید.
- دمای مناسب محیط برای استفاده از سمپلر، دمای ۲۰.۵ تا ۲۲.۵ درجه می باشد.
- کالیبراسیون سمپلر ها الزاما باید هر ۴ ماه یکبار طبق استاندارهای موجود، صورت گیرد.
کالیبراسیون دستگاه الایزا ریدر
- یک محلول رنگی را به مقدار یکسان در چاهک ها ریخته و جذب نوری آنها را بخوانید. سپس پلیت ها را بیرون آورده و مجددأ ۱۸۰ درجه بچرخانید و دوباره جذب نوری آن را بخوانید. چنانچه در هر دو حالت جذب مشابه را دیدید دستگاه کالیبر است.
- جهت بررسی کالیبره بودن موتوری که پلیت را جابجا می کند، از یک پلیت خالی استفاده کنید. در صورت نبود اختلاف معنی دار بین ستون اول و آخر می تواند صحت خوانش دستگاه الایزا را تایید نمود.
سوالات متداول خطا در الایزا (خطاهای رایج در الایزا )
حضور بک گراند و مقدار بالای کنترل منفی
- آلوده شدن چاهک های کنترل منفی با کنترل مثبت
- هنگام شستشو مراقب باشید از چاهک کناری داخل نمونه ریخته نشود.
- آلوده بودن ویال های اصلی کنترل منفی ( از بسته بودن درب ظرف مطمئن شوید)
- از سرسمپلر مشترک استفاده نکنید.
- شستشوی ناکافی و یا آلوده شدن کنترل منفی با آنزیم کنژوگه:، ممکن است باعث شود تا شستشو کامل انجام نگردد
دلایل گسترش رنگ با سرعت کم در تکنیک الایزا و راه حل آن (مقادیر پائین کنترل مثبت )
- محلول کروموژن – سوبسترا به درستی تهیه نشده است.
- آلودگی سوبسترا به اسید و یا آلودگی کنترل مثبت به باکتری
- دمای نامناسب در مدت انکوباسیون (دمای کم محیط)
- مقدار نمونه کمتر از مقدار برداشته شده است.
دلایل ظهور رنگ در تمام چاهکهای پلیت
- محلول سوبسترا با کونژوگه آلوده است.
- محلول شستشو کمتر از میزان لازم می باشد.
- در هنگام انکوباسیون سوبسترا پلیت در معرضمستقیم نور قرار گرفته است.
از مهمترین دلایل واکنش های مثبت کاذب،
می توان به شستشوی کم نمونه، وجود گلبول قرمز در نمونه سرم، دمای بالای انکوباسیون و غلظت بالای آنزیم کنژوگه در محلول رقیق کننده اشاره کرد.
از دلایل عدم همخوانی تکرارهای نمونه ها
ایجاد حباب در نمونه، اثرانگشت در پلیت، شستشوی ناقص و خطای سمپلینگ می باشند.
غلظت بالای نمونه یا خارج از رنج استاندارد
ارتباط مستقیم با جذب نوری نمونه دارد. ( لازم است در این حالت نمونه با کالیبراتور رقیق شود )
یکی از راه حل های مشکل مقدار رنگ خیلی کم در تکنیک الایزا
دمای پایین اتاق (زیر ۲۰ درجه سانتی گراد )
تکه تکه شدن رنگ (رسوب و ذرات سیاه رنگ درچاهک)
میتواند از دلایل طولانی شدن زمان واکنش آنزیم کنژوگه و سوبسترا در انجام روش الایزا
راه حل طلائی ما برای انجام تکنیک های صحیح و بی نقص تست های الایزا شما
آزمایشگاه های تحقیقاتی و پژوهشی هیستوژنوتک با داشتن کادری مجرب و متخصص در تکنیک های مختلف آزمایشگاهی از جمله الایزا، می تواند این تست پر هزینه را بدون خطای انسانی پیش ببرد. علاوه بر این با توجه به وجود استاندارهای ایزو در مجموعه دانش بنیان و شتاب‌دهنده هیستوژنوتک تمام تجهیزات از حساسیت های بالایی برخوردار می باشد که این مهم به مراتب خطاهای رایج تکینکی در تست الایزا را کاهش می دهد. از طرفی این مرکز با داشتن انواع کیت های تحقیقاتی الایزا در تمام مسیرهای سیگنالینگی جهت بررسی آنالیزی پروتئین ها، می تواند با بالاترین کیفیت و پایین ترین زمان، هزینه ها دانشجویان و اساتید محترم را برای اجرای این تکنیک مهم و کاربردی کاهش دهد.
