آموزش جامع رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز (Jones) در آزمایشگاه بافت‌شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز در بافت شناسی

رنگ‌آمیزی جونز یک رنگ متنامین نقره-اسید پریودیک-شیف (Methenamine silver-PAS) است که در بافت‌شناسی به عنوان تکنیکی اختصاصی استفاده می‌شود. این رنگ‌آمیزی همچنین با نام متنامین پاس با اختصار MPAS نیز شناخته شده است. تکنیک رنگ آمیزی جونز بر اساس اصول واکنش کاهش‌ اکسیداسیون (Oxidation-reduction) است که اجزای کربوهیدراتی غشای پایه را اکسید می‌کند. جونز با رنگ آمیزی غشاهای پایه، فیبرهای رتیکولوم، به طور گسترده در تحقیقات و تشخیص پزشکی بیماری‌های کلیوی استفاده می‌شود. در این مقاله با اصول و پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی جونز در بافت شناسی آشنا می‌شویم.

تاریخچه رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز

جونز در ابتدا استفاده از رنگ هماتوکسیلین و ائوزین را پیشنهاد کرد. در طی سال‌ها، یک رنگ جایگزین SF سبز روشن در اولویت بسیاری از موسسات قرار گرفته شد. در اوایل دهه ۱۹۹۰، در ملبورن، استرالیا، روشی توسعه یافت که از رنگ تری کروم ماسون به عنوان روشی بهبودی برای رنگ هماتوکسیلین و ائوزین در نظر گرفته شد، زیرا توانست فیبرین را نشان دهد و وجود رسوبات پروتئین گلومرولی را برجسته کند اما هنوز تغییرات ساختاری گلومرول‌ها به صورت دقیق و واضح قابل مطالعه نبود. بنابراین در صورت نیاز به نشان دادن ویژگی‌های دقیق گلومرول، بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی نیاز داشت که جونز رنگ‌آمیزی جونز را برای افزایش حساسیت با میکروسکوپ نوری ارائه داد.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز در بافت شناسی

رنگ‌آمیزی جونز معمولاً در آسیب شناسی کلیه برای نشان دادن جزئیات دقیق گلومرولاروپاتی ها استفاده می شود، از زمانی که Jones برای اولین بار مزایای چنین تکنیکی را توصیف کرد، این امر رایج بوده است. بیماری‌های مختلف گلومرولونفریت یا التهاب مویرگ‌های کلیوی از جمله آزوتمی (Azotemia)، نفروز لیپیدی (lipid nephrosis) و غیره با رنگ‌آمیزی جونز قابل مطالعه می‌باشد.

نگاهی اجمالی به غشای پایه‌ی رنگ شده با جونز

غشای پایه تقریباً در هر بافتی از بدن قرار دارد. غشاهای پایه می‌تواند در زیر سلول‌های اندوتلیال و اپیتلیال قرار گیرد. سلول‌ها را از بافت همبند زیرین و یا سلول‌های اطراف احاطه کننده مانند ماهیچه‌ها (میوفیبریل‌ها)، چربی، و سلول های عصبی (نوروفیبریل) جدا می کند. در گلومرول کلیه (یعنی شبکه ای از رگ های خونی کوچک)، غشای پایه بین لایه اندوتلیال و اپیتلیال قرار دارد تا سد فیلتراسیون گلومرولی را تشکیل دهد. همچنین در ریه‌ها، غشای پایه بین آلوئول ها (یعنی کوچکترین کیسه‌های هوایی) و مویرگ‌های ریوی یافت می شود. در اتصالات عصبی-عضلانی، غشای پایه در داخل فضای سیناپسی (فضای بین نورون و فیبر عضلانی) یافت می‌شود.

غشای پایه عمدتاً به عنوان پشتیبان ساختاری ایفای نقش می‌کند چرا که به سلول‌ها کمک می‌کند تا به بافت های زیرین متصل شوند. همچنین به عنوان یک مانع عمل می‌کند و از حمله سلول‌های سرطانی به لایه‌های بافتی عمیق‌تر جلوگیری می‌کند و در تنظیم رفتار سلولی، مانند تکثیر، تمایز، چسبندگی یا متاستاز ضروری است. آنژیوژنز، که تشکیل عروق خونی جدید است، نیز توسط غشای پایه انجام می شود، زیرا اجزای اصلی غشای پایه، مانند کلاژن نوع IV، نقش مهمی در این فرآیند دارند. در برخی از بیماری‌ها تغییرات مورفولوژی و عملکردی در غشای پایه اتفاق می‌افتد که این تغییرات در پاتولوژی به عنوان معیاری جهت بررسی بیماری‌ها در نظر گرفته می‌شود.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی جونز

یکی از متداول بافت‌هایی که در تکنیک رنگ‌‌آمیزی جونز برای غشاء پایه مورد استفاده قرار می‌گیرد، بافت کلیه بصورت بیوپسی از انسان و حیوانات آزمایشگاهی مانند رت، خرگوش، موش و غیره می باشد.

در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی جونز می‌پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز در بافت‌شناسی

جهت انجام تکنیک رنگ‌آمیزی JONES˙ Method ، در ابتدا چند محلول می بایست تهیه گردد. برای تهیه محلول ۰.۲ درصد کلراید طلا، یک سی‌سی کلراید طلا را به ۵۰ سی‌سی آب مقطر اضافه می کنیم. محلول Methenamine Silver را از ترکیب ۴۰۰ سی سی Methenamine 3% و ۲۰ سی‌سی محلول نقره نیترات تهیه کرده و نهایتا برای تهیه محلول working، ۵۰ سی‌سی از محلول Methenamine silver را با ۶ سی‌سی از محلول ۵% بوراکس (۵ گرم سدیم بورات در ۱۰۰ سی‌سی آب مقطر) مخلوط می‌کنیم.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز

1. برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۲-۴ میکرون تهیه می‌کنیم. هر چه برش نازک‌تر باشد، رنگ‌آمیزی غشای پایه بهتر انجام می‌شود.
2. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با اتانول این مرحله انجام میشود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
3. آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های مختلف از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
4. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ‌آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی جونز

1. نمونه‌های فیکس شده را در محلول پریودیک اسید ۱% به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۶۰ درجه فور یا حمام آب قرار می‌دهیم.
2. اسلایدها را دو دقیقه با آب مقطر آبکشی می‌کنیم.
3. اسلایدها را در جار رنگ‌آمیزی محلول Methenamine Silver در حمام آب یا فور با دمای ۶۰ درجه قرار داده و هر ۵ دقیقه اسلایدها را چک میکنیم تا به رنگ قهوه‌ای روشن ظاهر شوند (با میکروسکوپ می توانیم رنگ غشاها را بررسی کنیم). نهایتا اسلایدها را از محلول بیرون آورده و با آب مقطر گرم می‌شوییم.
4. روی هر لام، ۲۰ قطره کلراید طلا ۰.۲% ریخته تا خاکستری شود.
5. ۵ الی ۶ مرتبه لام های نمونه را با آب مقطر می‌شوییم.
6. لام‌ها را به مدت ۱ دقیقه در سدیم تیوسولفات ۳% انکوبه کرده و مجددا لام‌ها ۵ مرتبه با آب مقطر می شوییم.
7. در این مرحله می توانیم از پروتکل رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین جهت رنگ نمودن هسته سلول‌ها استفاده نماییم.
8. لام ها را با لامل و چسب انتلان مونت نموده و نهایتا پس از اتمام مراحل رنگ‌آمیزی جونز، لام‌های آماده شده را با میکروسکوپ نوری بررسی می‌کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی جونز

مواد مورد نیاز

• اتانول مطلق
• پارافین
• آب مقطر
• چسب انتلان
• زایلین
• محلول پریودیک اسید ۱%
• محلول متنامین ۳% (Methenamine)
• نقره نیترات
• سدیم بورات
• کلراید طلا ۰.۲%
• سدیم تیوسولفات ۳%

تجهیزات مورد نیاز

• میکروسکوپ نوری
• دستگاه گرمکن اسلاید بافتی
• دستگاه میکروتوم
• جار رنگ‌آمیزی لام
• لام و لامل
• فور

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی جونز

رنگ‌آمیزی جونز یا نقره ای متنامین جونز (JMS) برای نشان دادن غشای پایه گلومرولی در بخش‌های کلیه استفاده می‌شود. غشاهای پایه نوعی بافت همبند هستند که سلول های اپیتلیال روی آن قرار می گیرند. در کلیه، غشاهای پایه گلومرولی به عنوان فیلتر عمل می کنند. ضخیم شدن غشای پایه گلومرولی اغلب نشانه بیماری کلیوی و دیابت است. تشخیص این غشاها با رنگ‌آمیزی H&E به طور قابل توجهی دشوار است.

پریودیک اسید از مواد حاوی کربوهیدرات خاص آلدهیدهایی تشکیل می‌دهد که محلول نقره متنامین را به صورت انتخابی به نقره فلزی کاهش می‌دهند. از کلراید طلا استفاده می شود که بخش های بافت را رنگ می کند و نقره فلزی را به طلای فلزی تبدیل می کند. سپس نقره احیا نشده و کلراید طلای اضافی توسط تیوسولفات سدیم حذف می شوند. سپس این بخش با رنگ سبز روشن رنگ‌آمیزی می شود. نتایج مورد انتظار در رنگ آمیزی جونز بدین صورت می‌باشد: غشایه پایه به رنگ سیاه، هسته سلول‌ها آبی، سیتوپلاسم یا پس زمینه با رنگ صورتی.

تغییرات گلومرولی می‌تواند فقط در برخی از گلومرول ها یا در تقریبا در همه گلومرول ها باشد. اولین گام در ارزیابی تغییرات گلومرولی، تعیین نحوه تغییرات گلومرولی است. گلومرول ها می توانند اسکلروز گلومرولی را نشان دهند. وقتی این اتفاق می‌افتد، تعیین علت آسیب غیرممکن است. به همین در پاتولوژی از رنگ‌آمیزی های اختصاصی از جمله جونز برای بررسی دقیق‌تر استفاده می‌کنند.

گلومرولونفریت مامبرونوپرولیفراتیو ضایعه گلومرولی (Membranoproliferative Glomerulonephritis) با تکثیر اندوکاپیلاری ویا مزانژیال و ضخیم شدن دیواره‌های مویرگ توسط رسوبات ساب اندوتلیال IgG و یا نوع دیگری از تغییرات ساب اندوتلیال (بین اندوتلیوم و غشای پایه) می باشد. تغییرات غشای پایه با رنگ آمیزی جونز به خوبی قابل آنالیز می‌باشد. شکل ۳ ضخیم شدن غشای پایه گلومرول ها در بیماری گلومرولونفریت مامبرونوپرولیفراتیو را نشان می‌هد.

ارائه خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز در آزمایشگاه بافت شناسی

روش رنگ‌آمیزی از تکنیک‌های با ارزش در آزمایشگاه بافت‌شناسی است و برای ایجاد تمایز نمودن جزیی از بافت جهت آنالیز دقیق نمونه های بافتی مورد نیاز است. یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه‌های بافتی، رنگ‌آمیزی اختصاصی غشای پایه در بافت های موجود زنده از جمله حیوان آزمایشگاهی به نام رنگ آمیزی اختصاصی جونز است.

در آزمایشگاه بافت‌شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، از نمونه‌های بافتی مختلف، برش‌های بافتی با اندازه در حد میکرومتری و دارای کیفیت بالا تهیه کرده و با بکار بردن انواع تکنیک‌های رنگ‌آمیزی‌های عمومی و اختصاصی از جمله خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی جونز در بافت به بررسی و مطالعه نمونه‌های بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح‌های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.

جمع بندی

اصطلاح رنگ آمیزی های اختصاصی مدت‌هاست که برای اشاره به تعداد زیادی از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی جایگزین استفاده می‌شود. این رنگ های اختصاصی زمانی استفاده می شوند که رنگ آمیزی های عمومی مانند H&E تمامی اطلاعات مورد نیاز از بافت هدف را در اختیار محقق یا پاتولوژیست قرار نمی‌دهد. از این رو تکنیک‌های رنگ‌آمیزی اختصاصی بافت‌های بدن می‌تواند برای تحقیقات پاتولوژی بیماری‌های مختلف بسیار کمک‌کننده باشد. همانطور که توضیح داده شد رنگ‌آمیزی اختصاصی بافت کلیه و شناسایی بیماری‌های کلیوی، روش رنگ آمیزی جونز می‌باشد که در تحقیقات هیستوپاتولوژی بیماری‌های کلیه حائز اهمیت است.

سوالات متداول

❔ در رنگ‌آمیزی جونز کدام بخش از بافت بررسی می‌شود؟
✔️ بافت همبندی به نام غشای پایه نمونه های بافت در تکنیک جونز مطالعه می‌شود.

❔ غشای پایه در رنگ آمیزی جونز چه رنگ می شود؟
✔️ در پروتکل رنگ آمیزی غشای پایه سیاه رنگ می‌شود.