تولید آنتی بادی های مونوکلونال

آنتی بادی های مونوکلونال

آنتی بادی های مونوکلونال در محیط آزمایشگاه از کلونینگ یک رده از لنفوسیت های B بر اساس گیرنده های پروتئینی یک آنتی ژن خاص، ساخته می شوند.

آنتی بادی مونوکلونال میل ترکیبی تک ظرفیتی داشته و فقط به اپیتوپ اختصاصی خود متصل می شوند. این نوع از آنتی بادی ها در امر تشخیص و درمان کاربرد گسترده ای دارند و توسط رده های سلولی یا کلون های به دست آمده از حیوانات آزمایشگاهی مثل موش، رت، خرگوش و … که با ماده مورد مطالعه ایمن شده اند تولید می شوند. رده های سلولی از ترکیب لنفوسیت های B از حیوان ایمن شده با سلول های میلوما (myeloma cell) تولید می شوند.

برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

مطلب پیشنهادی: آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی – تولید آنتی بادی های پلی کلونال

تولید آنتی بادی های مونوکلونال

آنتی بادی های مونوکلونال توسط یک کلون از لنفوسیت های B تولید می شوند. این سلول‌ها را می‌توان با ادغام با سلول‌های میلوما نامیرا کرد و در نتیجه سلول‌های هیبریدوما (hybridoma cells) به وجود می آید که قادر به تولید مقادیر تقریبا نامحدود آنتی‌بادی‌ های مونوکلونال هستند.

مراحل تولید آنتی بادی های مونوکلونال

• تولید لنفوسیت های B با آنتی ژن اختصاصی
• ادغام لنفوسیت های B با سلول‌های میلوما
• غربالگری و انتخاب کلون هیبریدوم
• شناسایی و تعیین مشخصات آنتی بادی مونوکلونال

تولید لنفوسیت های B با آنتی ژن اختصاصی

به هر ماده خارجی که منجر به پاسخ ایمنی شود ایمونوژن گفته می شود. اغلب اوقات، ایمونوژن همراه با یک ادجوانت به عنوان تحریک کننده غیر اختصاصی پاسخ ایمنی در نظر گرفته می شود. معمولا پروتئین ها به صورت زیر جلدی و سلول ها به صورت داخل صفاقی تزریق می شوند. تزریق منظم ایمونوژن برای رسیدن به پاسخ ایمنی مطلوب مورد نیاز است، که با استفاده از روش خونگیری دمی در موش و رت کنترل می شود.

این تقویت پاسخ ایمنی منجر به تغییر کلاس ایمونوگلوبولین ها و تولید آنتی بادی هایی با میل ترکیبی بالاتر بواسطه جهش در آنتی بادی  ایجاد می شود. معمولا آنتی بادی های مونوکلونال IgG ارجع هستند زیرا کمتر مستعد تخریب اند.

مطلب پیشنهادی: انواع تزریقات در موش و رت و سایر حیوانات آزمایشگاهی – خونگیری از موش رت و سایر حیوانات آزمایشگاهی

ادغام لنفوسیت های B با سلول‌های میلوما

فرآیند هیبریداسیون، بر ادغام لنفوسیت های B با سلول های میلوما سازگار با بافت مورد نظر متمرکز است. رده های مختلف سلول های میلوما با کشت در محیط های حاوی ۸-آزاگوانین از لحاظ ترشح آنزیم هیپوگزانتین گوانین فسفریبوزیل ترانسفراز (HGPRT) انتخاب می شوند.

این آنزیم در فرآیند انتخاب هیبریدوم پس از ادغام سلول ها نقش اساسی دارد. در فرآیند ادغام، لنفوسیت های B  با سلول های میلومای فاقد آنزیمHGPRT به همراه یک عامل ادغام کننده مانند پلی اتیلن گلیکول مخلوط می شوند. پس از ادغام، هیبریدوم‌ لنفوسیت های B و میلوما ایجاد می شود. هنگامی که این سلول‌های هیبریدی تشکیل و در چاهک‌های کشت بافت قرار گرفت، سلول‌های میلوما ترکیب نشده باید حذف شود. چرا که سلول‌های میلوما پتانسیل رشد بیشتری نسبت به سلول‌های دیگر، به ویژه هیبریدوم‌های ضعیف دارند. این امر با استفاده از یک محیط انتخابی حاوی هیپوگزانتین، آمینوپترین و تیمیدین انجام می شود.

غربالگری و انتخاب کلون هیبریدوم

این مرحله بر شناسایی و انتخاب آن دسته از هیبریدوم هایی متمرکز است که آنتی بادی با ویژگی مناسب تولید می کنند. در فرآیند انتخاب باید دقت بسیاری نمود، در غیر این صورت هیبریدوم‌های ناخواسته منجر به اتلاف زمان و هزینه زیادی می شوند.

برای این منظور سوپرناتانت محیط کشت هیبریدوم ها توسط تکنیک الایزا برای واکنش‌پذیری و اختصاصیت آنتی‌بادی ها بررسی می‌شود. بنابراین، غربالگری برای حذف هیبریدوم های غیر اختصاصی در اولین فرصت ضروری است. بدیهی است که غربال کردن سوپرناتانت ها باید در مراحل یکسانی از رشد هیبریدوم ها انجام شود. این رویکرد به این معنی است که غربالگری تقریباً باید هر روز انجام شود زیرا همه هیبریدوم ها با سرعت یکسانی رشد نمی کنند.

برای مشاهده مطلب کامل تکنیک الایزا اینجا کلیک کنید

برای اطلاع از لیست کیت های الایزای موجود و قیمت تست الایزا اینجا کلیک کنید

شناسایی و تعیین مشخصات آنتی بادی مونوکلونال

تجزیه و تحلیل هیبریدوم تولید کننده آنتی بادی مونوکلونال مورد نظر از نظر واکنش پذیری، اختصاصیت و واکنش های متقابل را می توان با استفاده از سوپرناتانت محیط کشت یا تخلیص ایمونوگلوبولین ها انجام داد. با این حال، اغلب لازم است که هیبریدوم‌ها را مجدداً کلون کرد (مثلاً با رقت‌سازی محدود این کار انجام شود). زیرا یک کلنی اصلی ممکن است حداقل دو جمعیت از لنفوسیت های B ادغام شده را در خود داشته باشد که در صورت ادامه کار می‌تواند منجر به داده‌ های مبهم ناشی از آنتی‌بادی‌هایی با نوع، ویژگی و میل ترکیبی متفاوت شود.

به همین دلیل، تعیین ایزوتایپ آنتی بادی نه تنها برای تعریف کلاس یا زیر کلاس ایمونوگلوبولین ها مفید است، بلکه به شناسایی حضور یک ایزوتیپ منفرد (به عنوان مثال،IgG1  یا مخلوطی از دو ایزوتایپ مانند IgM و IgG2b  ) کمک می کند. علاوه بر این، آگاهی از ایزوتیپ یک آنتی بادی مونوکلونال به تعیین مناسب ترین تکنیک تخلیص توسط ستون کارماتوگرافی برای سوپرناتانت محیط کشت کمک می کند.

یک جنبه مهم شناسایی آنتی بادی های مونوکلونال مربوط به طبقه بندی آنها در سیستم های سنجش مختلف است. که ارتباط مستقیم با پتانسیل آنتی بادی به عنوان یک معرف تشخیصی دارد. زیرا برخی از آنتی بادی های مونوکلونال در برخی از سیستم ها عملکرد خوبی دارند اما در برخی دیگر عملکرد مناسبی ندارند. این پدیده که محدودیت سنجش نامیده می شود، به نحوه تشخیص اپی توپ هدف توسط آنتی بادی در سیستم سنجش مورد استفاده، مربوط می شود. به عنوان مثال یک اپی توپ هدف می تواند با توجه به تکنیک اتخاذ شده پوشانده، دناتوره یا غیرقابل دسترس شود.

برای اطلاع از لیست بانک انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید

شناسایی آنتی بادی ها همچنین فرصتی را برای آزمایش آنتی بادی بر روی طیف گسترده ای از آنتی ژن های مرتبط فراهم می کند، به ویژه اگر آنتی بادی های مونوکلونال برای اهداف هیستوپاتولوژیک تولید شده باشند. پس از اطمینان از هیبریدوم، تولید انبوه یک آنتی بادی مونوکلونال را می توان با استفاده از فلاسک های کشت چند طبقه یا سیستم های کشت سه بعدی نظیر Technomouse به دست آورد.

مطالب مرتبط: آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی – تولید آنتی بادی های پلی کلونال – تکنیک الایزا – تکنیک وسترن بلات
خدمات مرتبط: انجام تکنیک وسترن بلات و الایزا با بانکی غنی از انواع آنتی بادی – انجام خدمات ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی با بانکی غنی از انواع آنتی بادی