آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد (Alizarin Red) در آزمایشگاه بافت شناسی
⭐آنچه در این مطلب خواهید خواند
مقدمه ای از رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد در بافت شناسی
رنگ آلیزارین رد اِس (Alizarin red S) یک نمک سدیم آلی است که دارای ۳،۴-دی هیدروکسی-۹،۱۰-دی-اکسو-۹،۱۰-دی‌هیدروآنتراسن-۲-سولفونات، به عنوان ضد یون، است. معمولاً برای رنگ‌آمیزی اسکلت‌های جنین از پستانداران کوچک استفاده میشود. در بافت شناسی به عنوان رنگ بافتی نقش دارد. رنگ آمیزی آلیزارین رد S یک تست ارزشمند در بافت‌شناسی است که مکمل بررسی میکروسکوپی نوری برای تشخیص کریستال‌های کلسیم است.
آلیزارین رد S بیشترین حساسیت را برای تشخیص کریستال‌های پیروفسفات کلسیم دارد زیرا کریستال‌ها بدون توجه به اینکه چقدر ضعیف یا قوی هستند، رنگ می‌گیرند. رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز S بین انواع ترکیبات کلسیمی تمایز قائل نمی شود. بنابراین، انواع مختلف ترکیبات کلسیمی را می توان تنها زمانی تشخیص داد که ویژگی های مورفولوژیکی کریستالی معمولی نیز وجود داشته باشد.
تاریخچه رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد
رنگ آلیزارین رد توسط دو شیمیدان آلمانی به نام Graebe و Libermann در سال ۱۸۷۱ کشف شد. رنگ آلیزارین از اوایل دوران باستان در رنگرزی پارچه استفاده می شده است. همچنین در زمین‌شناسی، در مرجان‌های زنده از آلیزارین رد اس برای علامت گذاری لایه های رشد روزانه موجود استفاده شده است.
در بافت شناسی ترکیبات کلسیم آلیزارین یا کلسیم آلیزارین قرمز اِس اغلب به عنوان “دریاچه (lake)” یا “کمپلکس (Complex)” نامیده می شوند. داده‌های طیف‌سنجی شیمیایی و مادون قرمز نشان داد که این ترکیبات نمک هستند نه کلات فلزی (Chelate). در شیمی رنگ‌ها، اصطلاح دریاچه به نمک کم محلول یا نامحلول رنگ محلول در آب اشاره دارد.
اولین مقاله موجود در مورد رنگ‌آمیزی اسکلتی پروتکلی است که در آن آلیزارین قرمز برای رنگ آمیزی استخوان‌ها و هیدروکسید پتاسیم برای پاکسازی نمونه ها در سال ۱۸۹۷ استفاده شده است. پروتکل بعدی رنگ آمیزی آلیزارین رد در سال ۱۹۰۶ بیان شد که پس از آن تغییرات این دو روش (آلیزارین رد و هیدروکسیدپتاسیم) به صورت پروتکل‌های تک رنگی منتشر شدند.
انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد در بافت شناسی
رنگ آمیزی آلیزارین رد جهت شناسایی و بررسی کلسیم در نمونه های بافتی بویژه بافت استخوان استفاده شود. واکنش رنگ آلیزارین کاملاً اختصاصی نیست و فلزاتی مانند منیزیم، منگنز، باریم، استرانسیوم و آهن ممکن است در واکنش آلیزارین و کلسیم تداخل داشته باشند، اما معمولاً غلظت این عناصر به اندازه‌ای نیست که در انجام تکنیک تداخلی رخ دهد.
در هیستوپاتولوژی، رنگ آمیزی آلیزارین رد برای تشخیص بیماریهای مختلف مرتبط با بافت استخوان و مایع مفصلی استفاده می شود. این بیماری‌ها شامل استئوآرتروز (arthritis)، آرتروز روماتوئید (rheumatoid arthritis) بیماری بلورهای کلسیم پیروفسفات دی هیدرات (calcium pyrophosphate dihydrate (CPPD) crystals)، بیماریهای مفصلی، رسوب هیدروکسى آپاتیت، دیالیز، نقرس، ناهنجاری‌های اسکلتی جنین و غیره هستند.
کاربرد دیگر رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین قرمز به عنوان تست تاییدی برای تمایز سلول¬های مزانشیمی انسانی و حیوانات آزمایشگاهی به سلول‌های استئوسیت در مطالعات کشت سلولی می‌باشد.
نگاهی اجمالی به بافت استخوان رنگ شده با آلیزارین رد
استخوان بخشی از سیستم اسکلتی انسان است که چهارچوبی را برای بدن و تحمل وزن بدن فراهم کرده و از اندام‌های حیاتی محافظت می‌کند. علاوه بر این میزبان سلول‌های خون‌ساز است و هموستاز آهن را حفظ می کند. استخوان بافتی است که در آن ماتریکس خارج سلولی سخت شده است تا بتواند یک عملکرد حمایتی را انجام دهد. اجزای اساسی استخوان، مانند تمام بافت‌های همبند و غضروف، سلول‌ها، فیبر و ماتریکس خارج سلولی هستند.
سه سلول مهم بافت استخوانی از جمله استئوبلاست ها، استئوسیت ها، استئوکلاست ها وجود دارد که هر کدام عملکردهای منحصر به فردی دارند و از دو رده سلولی متفاوت مشتق شده اند. استئوبلاست ها ماتریکس استخوان را سنتز می کنند و مسئول معدنی شدن آن هستند. آنها از سلول های استئوپروژنیتور (Osteoprogenitor )، یک رده سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق شده اند. استئوسیت‌ها استئوبلاست های غیر فعالی هستند که در استخوانی که تشکیل داده‌اند به دام افتاده اند. استئوکلاست‌ها ماتریکس استخوان را از طریق فاگوسیتوز تجزیه می‌کنند. استئوکلاست‌ها از رده سلولی مونوسیت (ماکروفاژ) مشتق شده اند. تعادل بین فعالیت استئوبلاست و استئوکلاست تضمین می‌کند که استخوان نه بیش از حد تولید شود و نه بیش از حد تجزیه شود. این سلول ها ماتریکس استخوانی را ساخته و تجزیه می‌کنند که از موارد زیر تشکیل شده است: استوئید، که ماتریکس غیر معدنی متشکل از کلاژن نوع I و گلیکوزآمینوگلیکان ها است و هیدروکسی آپاتیت کلسیم، یک کریستال نمک کلسیم است که سبب استحکام استخوان میشود.
غلظت بالای مواد معدنی مبتنی بر کلسیم و فسفات در سرتاسر بافت همبند عامل ماهیت کلسیفیه سخت آن است که اختلال در غلظت مواد بافت استخوانی سبب بروز بیماری‌ها میشود که در پاتولوژی توسط پاتولوژیست و محقق با استفاده از تکنیک‌های مختلف از جمله رنگ‌آمیزی مورد بررسی قرار می‌گیرند.
انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی آلیزارین رد
مایع سینوویال (Synovial) یا مایع مفصلی، انواع بافت استخوان مانند فشرده، اسفنجی، بافت زیر غضروفی انسان و حیوانات آزمایشگاهی و همچنین بافت اسکلتی جنین حیوانات اسکلتی را می‌توان با رنگ آمیزی آلیزارین رد مطالعه نمود.
در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد می‌پردازیم.
پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد در بافت‌شناسی
جهت انجام روش رنگ آمیزی با آلیزارین رد S، می‌بایست ابتدا محلول رنگی مورد نظر را طبق پروتکل شرکت تولیدکننده پودر رنگی آلیزارین رد، با حل کردن مقدار ذکر شده در پروتکل در حجم مشخصی از آب مقطر تهیه کرده و pH محلول را با آمونیوم هیدروکساید ۱۰% تنظیم می‌کنیم. میزان pH محلول رنگی بسیار مهم و تاثیرگذار در روند نتیجه انجام تکنیک است، لذا ضروری است محلول تازه تهیه شود و یا برای محلول با ماندگاری بیش از یک ماه، pH را مجددا چک می‌کنیم.
مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد
- برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۳-۵ میکرون تهیه می‌کنیم.
- آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با اتانول این مرحله انجام میشود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
- آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های مختلف از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
- اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی رنگ می‌کنیم.
مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد
- اسلایدهای حاوی نمونه بافتی فیکس شده را به مدت ۳۰ ثانیه الی۵ دقیقه در جار لام حاوی محلول آلیزارین رد قرار می‌دهیم و با میکروسکوپ نوری بررسی می‌کنیم اگر رنگ رسوبات کلسیمی قرمز-نارنجی باشد، اضافه های رنگ را با تکان دادن اسلاید حذف می‌کنیم.
- اکنون هر یک از لام ها را با ۲۰ قطره استون دهیدراته می‌کنیم. سپس به هر یک از نمونه‌ها ۲۰ قطره محلول استون-زایلین (نسبت ۱:۱) اضافه می‌کنیم.
- لام نمونه‌ها را با زایلین شفاف سازی نموده و پس از خشک شدن لام، با چسب انتلان و لامل مونت می کنیم.
تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی آلیزارین رد
مواد مورد نیاز
- اتانول مطلق
- پارافین
- آب مقطر
- استون
- چسب انتلان
- زایلین
- آمونیوم هیدروکساید ۱۰%
- پودر آلیزارین رد
تجهیزات مورد نیاز
- میکروسکوپ نوری
- دستگاه میکروتوم
- دستگاه گرمکن اسلاید بافتی
- جار رنگ‌آمیزی لام
- لام و لامل
جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.
تفسیر نتایج رنگ آمیزی آلیزارین رد
آلیزارین قرمز می‌تواند کمپلکس های قرمز پایدار با یون های فلزی زیادی تشکیل دهد و اغلب به عنوان یک شاخص فلزی در تجزیه و تحلیل استفاده می شود. کلسیم در استخوان های انسان به فراوانی یافت می شود و بسیاری از رنگ‌ها می‌توانند با کلسیم کلات تشکیل دهند، از جمله آلیزارین قرمز. آلیزارین قرمز برای رنگ‌آمیزی مقادیر کم رسوب نتایج قابل اعتمادتری به دست می دهد و برای رنگ آمیزی بافت با مقادیر کمی نمک های کلسیم مناسب است.
امروزه بسیاری از محققین از رنگ آمیزی آلیزارین قرمز و آلشین بلو در مطالعات خود برای ارزیابی رشد اسکلتی و ناهنجاری‌های اسکلتی حیوانات آزمایشگاهی جهت بررسی اثرات بسیاری از مواد شیمیایی یا گیاهی و داروها استفاده می‌کنند. پس از یک یا چند دوره تیمار حیوان آزمایشگاهی با داروی مورد مطالعه، جنین های تحت بررسی را با آلیزارین قرمز رنگ آمیزی نموده و اثر دارو را بر بافت اسکلتی و ناهنجاری‌های آن مطالعه می‌کنند. آنالیز نمونه‌های رنگ آمیزی آلیزارین رد در طرح‌های پژوهشی اثر دارو یا ماده شیمیایی بر بیماریهای اسکلتی بسیار مهم و بااهمیت می‌باشد.
تکنیک رنگ‌آمیزی بخش مهمی از جریان کار در آزمایشگاه بافت‌شناسی است و برای ایجاد تمایز بین اجزای مختلف بافت‌ها جهت آنالیز دقیق نمونه بافتی مورد نیاز است. یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه های بافتی، رنگ آمیزی اختصاصی سیستم اسکلتی موجود زنده از جمله حیوان آزمایشگاهی به نام رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد یا آلیزارین قرمز است.
در آزمایشگاه بافت شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، از نمونه های بافتی مختلف برش‌های بافت میکرومتری با کیفیت تهیه کرده و با بکار بردن انواع تکنیک های رنگ آمیزی های عمومی و اختصاصی از جمله رنگ آمیزی اختصاصی آلیزارین رد اِس به بررسی و مطالعه نمونه‌های بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح‌های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.
جمع بندی
آنالیز بافت‌شناسی انواع نمونه‌های بافت انسانی رنگ‌آمیزی شده یک تکنیک استاندارد طلایی برای تشخیص پزشکی و تحقیقات بسیاری از بیماری‌ها است، زیرا مبنای اساسی هر ارزیابی پاتولوژیک، بررسی بافت رنگ‌شده‌ای است که روی یک اسلاید شیشه‌ای فیکس شده و با استفاده از میکروسکوپ نوری از لام تصویربرداری شده است. رنگ‌آمیزی آلیزارین رد یا همان رنگ آمیزی سیستم اسکلتی به عنوان تکنیکی مطمئن در مطالعات سیستم اسکلتی در مواجه با داروهای سنتز شده و بررسی تاثیر احتمالی داروها بر رشد و تکامل اجزای بافت استخوانی شناخته شده است.
سوالات متداول
❔ در تکنیک رنگ آمیزی آلیزارین رد رسوبات کدام عنصر معدنی رنگ میشود؟
✔️ هدف رنگ آمیزی آلیزارین رد، رنگ نمودن کلسیم موجود در بافت‌های اسکلتی می باشد.
❔ کدام ناهنجاری‌های جنین حیوانات آزمایشگاهی با رنگ‌آمیزی آلیزارین رد مطالعه میشود؟
✔️ ناهنجاری‌های اسکلتی جنین در حال رشد با آلیزارین قرمز تشخیص و مطالعه میشود.
