بافت شناسیمطالب علمی

آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله (Cresyl Violet) در آزمایشگاه بافت‌شناسی

🔷 مقدمه ای از رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله در بافت‌شناسی

رنگ آمیزی کریزیل ویوله (Cresyl Violet) یا نیسل یک رنگ آمیزی تخصصی و استاندارد بافتی می باشد که جهت رنگ آمیزی اجسام نیسل (Nissl Substance) در سیتوپلاسم نورون‌های سیستم عصبی مرکزی و محیطی در بافت فیکس شده در فرمالین یا پارافین استفاده می شود. کریزیل ویوله یک ترکیب ارگانیک با فرمول شیمیایی C19H18CIN3O است.
در این روش، اجسام نیسل (Nissl bodies) که جزء شبکه آندوپلاسمی زبر یا خشن محسوب می‌شوند، با استفاده از رنگ کریستال به رنگ بنفش رنگ‌آمیزی می شوند. بدنه‌های لکه‌دار Nissl به‌نظر می‌آیند جمع‌شده و بریده‌اند. رنگ‌آمیزی نیسل، اندازه‌گیری چگالی نورون‌ها را آسان می‌کند، زیرا سلول‌های رنگ‌آمیزی شده به وضوح مشخص هستند و به راحتی اندازه‌گیری می‌شوند. از طرفی برای رنگ آمیزی DNA درون هسته که در سلول های عصبی یافت می‌شود، استفاده می‌شود. این روش سلولهای عصبی را از سلول های گلیا متمایز می کند.
اجسام نیسل که به نام های گرانول نیسل یا ماده نیسل نیز شناخته شده اند، ساختارهای دانه‌ای مجزا در نورون‌ها هستند که از شبکه آندوپلاسمی خشن، مجموعه‌ای از سیسترن‌های موازی متصل به غشاء با ریبوزوم‌های روی سطح سیستوزولی غشاها تشکیل شده‌اند. اصطلاح اجسام نیسل به طور کلی به توده های مجزا از شبکه آندوپلاسمی زبر در سلول های عصبی اشاره دارد. لازم به ذکر است که تعداد زیادی شبکه آندوپلاسمی زبر معمولاً با تولید فراوان پروتئین‌ها مرتبط هستند .عملکرد اجسام نیسل به طور کلی مانند عملکرد شبکه آندوپلاسمی خشن است، در درجه اول سنتز و جداسازی پروتئین ها را برعهده دارند و به طورکلی می توان گفت که محل اصلی سنتز پروتئین در سیتوپلاسم عصبی هستند. اجسام نیسل در شرایط مختلف فیزیولوژیکی و در شرایط پاتولوژیک مانند آکسونوتمزیس (Axonotmesis) که به معنای آسیب آکسون و غلاف میلین است، تغییراتی را نشان دهند که در طی آن ممکن است اصطلاحا کروماتولیزه یا به عبارتی تا حد زیادی ناپدید شوند.

🔷 تاریخچه رنگ آمیزی کریزیل ویوله

رنگ کریزیل ویوله (Cresyl violet) در International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) ، بنام (۹-dimethylamino-10-methyl-benzo[a]phenoxazin-5-ylidene)ammonium chloride نامگذاری شده است. نام دیگر آن Cresole violet می باشد. در سال ۱۸۸۴ Nissl مطالعات گسترده روی بیماریهای ذهنی و مغزی انجام داده است که در حین مطالعاتش تغییراتی در سلولهای گلیال، بافت مغز، خون و رگ های خونی مشاهده نمود. تمامی مشاهدات خود را با تکنیک رنگ آمیزی خود بدست آورد. این تکنیک در سال ۱۸۹۴ توسط Franz Alexander Nissl ثبت شد و به افتخار او رنگ آمیزی نیسل نیز نامگذاری گردید.

ساختار شیمیایی رنگ کریزیل ویوله

🔷 انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله در بافت شناسی

روش رنگ آمیزی کریزیل ویوله که رنگ آنیلین پایه است RNA را به رنگ آبی می کند و جهت برجسته کردن ویژگی های ساختاری نورون‌ها استفاده می شود. این نوع رنگ آمیزی در بیولوژی و پزشکی به عنوان یک رنگ هیستولوژیک کاربرد دارد. یکی از کاربردهای این تکنیک استفاده از آن در آزمایشگاه تشخیص پزشکی جهت تشخیص و شناسایی هلیکوباکتر پیلوری (Helicobacter pylori) در بیماران و شناسایی کروموزوم X می باشد. از این روش برای تشخیص باکتری و قارچ ها در بک گراند نوری روشن، مشاهده و بررسی میکروسکوپی نوری و فلورسنتی اجسام نیسل در بافت عصبی، تصویربرداری از نورونها توسط نوروبیولوژیستها نیز مورد استفاده قرار می گیرد. از این نوع رنگ آمیزی در تحقیقات بافت شناسی مرتبط با انواع بیماریهای دستگاه عصبی مرکزی و محیطی از جمله بررسی میزان مرگ سلولی بعد از تیمار حیوان آزمایشگاهی مبتلا به بیماری سیستم عصبی با دارو نیز استفاده می شود.

🔷 نگاهی اجمالی به دستگاه عصبی رنگ شده با کریزیل ویوله

دستگاه عصبی شامل مغز، نخاع، دستگاههای حسی و عصب های اندام‌های مختلف بدن می باشد. مغز و نخاع جز دستگاه عصبی مرکزی (CNS) و اعصاب و اندام های حسی جز دستگاه عصبی محیطی (PNS) محسوب می شوند. دستگاه عصبی محیطی اطلاعات را از مرکز کنترل به سمت عضلات، غدد و اندام‌ها هدایت کرده و عملکرد آن‌ها را تنظیم می‌کنند. دستگاه عصبی از نورونها یا سلولهای عصبی و سلولهای نوروگلیا تشکیل شده است. مورفولوژی نورونها به علت داشتن زایده های سلولی بلند به نام آکسون نسبت به سلولهای دیگر بدن متفاوت است که با داشتن آنها در انتقال سیگنالهای الکتروشیمیایی به قسمت های مختلف بدن نقش دارند. سلولهای گلیال یا نوروگلیا به عنوان سلول کمک کننده در دستگاه عصبی ایفای نقش می کنند. هر سلول عصبی حدودا با ۱۰ تا ۶۰ سلول گلیال احاطه شده و در محافظت، تغذیه و عایق نورونها عمل می کند.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله

تکنیک رنگ آمیزی نیسل روی سلولهای عصبی بافت های سیستم عصبی مرکزی (مخ، مخچه) و سیستم عصبی محیطی انجام می‌شود. این بافت ها می‌تواند به صورت فریزشده، فیکس شده با پارافین یا فرمالین باشد.

پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله در بافت‌شناسی

روش رنگ آمیزی کریزیل ویوله که به آن رنگ آمیزی نیسل نیز معروف است، به رنگ‌های پایه مختلفی اطلاق می‌شود که به طور انتخابی مولکول‌های دارای بار منفی مانند DNA و RNA را هدف قرار می دهند. از آنجایی که ریبوزوم ها غنی از RNA هستند، به شدت بازوفیل می باشند. تجمع متراکم ریبوزوم‌های آزاد و متصل به غشاء در اجسام نیسل منجر به رنگ‌آمیزی آنها توسط رنگ نیسل می‌شود که توسط میکروسکوپ نوری قابل مشاهده اند.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ‌آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله

  • برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۳-۵ میکرون تهیه می‌کنیم.
  • آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با اتانول این مرحله انجام میشود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
  • آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های مختلف از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
  • اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله

برای توضیح پروتکل اجرائی و روش انجام رنگ آمیزی کریستال ویوله جهت رنگ کردن اجسام نیسل موارد زیر را به ترتیب می توان نام برد :

  1. کریزیل، هسته نیسل را که شبکه آندوپلاسمی زبر همه سلول ها از جمله نورون ها و گلیاها است را رنگ می کند.
  2. بر روی هر لام ( لام‌های بار مثبت یا لام های سیلانه ) که می تواند ۳ اسلاید بافتی داشته باشد، مقداری از آب دهیدراته ریخته و به مدت ۴۸ ساعت در دمای اتاق نگهداری میکنیم .
  3. اسلایدها پس از مدت کوتاهی در محلول PBS غوطه ور شده و سپس دو مرتبه به مدت ۱۰ دقیقه در اتانول به ترتیب در غلظت های ۵۰٪، ۷۰٪، ۹۵٪ قرار گرفته تا نهایتاً جهت آبگیری، سه مرتبه در غلظت ۱۰۰٪ قرار می دهیم.
  4. سپس لام ها را برای حذف لیپیدهای موجود، به مدت ۱ ساعت در کلروفرم غوطه ور می شوند.
  5. لام های حاوی برش های بافتی را مجدد حهت هیدراته شدن با کاهش غلظت اتانول مواجه می کنیم ( غلظت های ۱۰۰٪ (سه بار(،۹۵% و ۷۰ % (دو بار)، و متعاقباً به مدت ۱۰-۲۰ دقیقه در رنگ کریزیل بنفش ۰.۲۵ ٪ غوطه ور می شوند.
  6. سپس لامها به مدت کوتاهی در PBS غوطه ور و پس از شستشوی سریع در اتانول ۲۵ درصد، در اتانول ۵۰ درصد + اسید استیک ۰.۵ درصد به مدت حدود ۳ دقیقه برای کاهش رنگ آمیزی غیر اختصاصی و گلیا قرار می گیرند. ( برای از بین بردن آرتیفکت و موارد غیر بررسی )
  7. سپس اسلایدها با افزایش غلظت اتانول بین ۷۰ تا ۱۰۰ درصد دوباره آبگیری می گردند. آبگیری را تا زمانی انجام می شود که پس زمینه سفید شود و غشای هسته سلولهای موردنظر رنگ شود.
  8. در نهایت سه مرتبه هر بار ۱۰ دقیقه جهت شفاف سازی لام در محلول زایلن یا گزیلول قرار گرفته و توسط چسب انتلان و لامل را برای بررسی میکروسکوپی می چسبانیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی نیسل

مواد مورد نیاز

  • اتانول مطلق
  • آب مقطر
  • محلول PBS
  • چسب انتلان
  • زایلین
  • کریزیل ویوله
  • اسید استیک ۰.۵ درصد

تجهیزات مورد نیاز

  • میکروسکوپ نوری
  • دستگاه میکروتوم
  • دستگاه گرمکن اسلاید بافتی
  • جار رنگ­آمیزی لام
  • لام سیلانه و لامل

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ آمیزی کریزیل ویوله

روش رنگ آمیزی بسته به pH محلول رنگ آمیزی متفاوت است. در pH نزدیک به ۳.۰، فقط اجسام نیسل، هسته و غشاهای هسته ای به رنگ آبی روشن رنگ می شوند. هسته سلول گلیال بسیار کمی رنگ آمیزی می شود. با افزایش pH، رنگ به طور کلی تیره‌تر می‌شود و سیتوپلاسم سلول‌های عصبی، رشته‌های عصبی و سلول‌های گلیال نیز همزمان رنگ می‌شوند. اجسام تیره آبی تیره تا بنفش رنگ می شوند.

رنگ آمیزی کریزیل ویوله سلولهای عصبی در pH نزدیک به ۳
رنگ آمیزی کریزیل ویوله سلول‌های عصبی در pH بالا

ارائه خدمات رنگ آمیزی اختصاصی کریزیل ویوله در آزمایشگاه بافت شناسی

سلول‌های هر بافتی از بدن موجود زنده یک یا چند رنگ آمیزی اختصاصی خود را دارد که مطالعه و بررسی بافت را در مسیر تحقیقات در زمینه بیماریهای مختلف آسان می کند. لازم به ذکر است یکی از خدمات ارائه شده در بخش پاتولوژی شرکت بافت و ژن پاسارگاد، رنگ آمیزی های تخصصی انواع بافت های انسانی و حیوانات آزمایشگاهی می باشد که با تجهیزات آزمایشگاهی استاندارد و باکیفیت ترین مواد توسط کارشناسان باتجربه انجام می شود.
آزمایشگاه بافت شناسی هیستوژنوتک با استفاده از تجهیزات مطابق با استانداردهای آزمایشگاهی در ارائه خدمات رنگ آمیزی عمومی و اختصاصی بافت شناسی آماده همکاری با محققان، دانشجویان، اساتید می باشد. با ارائه نتایج آنالیز شده، کلیپ های آموزشی و پروتکل های رنگ آمیزی آماده خدمت رسانی است. آزمایشگاه بافت شناسی هیستوژنوتک قادر است کلیه مراحل صفر تا صد رنگ آمیزی های اختصاصی بافت را روی کلیه بافت های حیوانی و انسانی ارسال شده از سوی محققان و آزمایشگاه های تشخیصی پزشکی پاتوبیولوژی انجام دهد.

جمع بندی

یکی از رنگ آمیزی های پرکاربرد آزمایشگاه پاتولوژی، رنگ آمیزی کریزیل ویوله یا نیسل می باشد که جهت تشخیص و تمایز اجسام نیسل نورونها در نمونه های بافتی سیستم عصبی کاربرد دارد. این رنگ RNA های موجود در سلولها از جمله RNA ریبوزومی را به رنگ آبی تیره رنگ آمیزی می کند. این تکنیک همانند تکنیک های دیگر نیاز به دقت و تجربه بالا و تجهیزات آزمایشگاهی استاندارد نیاز دارد.

سوالات متداول

❔ رنگ‌آمیزی نیسل برای تشخیص کدام بیماری‌ها کاربرد دارد؟

✔️ رنگ آمیزی نیسل در بیماریهای مرتبط با دستگاه عصبی مرکزی مورد استفاده قرار می گیرد. از جمله این بیماریها می توان به آلزایمر، پارکینسون، پیری اشاره نمود.

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

10 + شانزده =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا