سلولی

بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی – بخش اول

روش های اندازه گیری استرس اکسیداتیو ROS سلولی

گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) مولکول‌های واکنش‌پذیر شیمیایی حاوی اکسیژن هستند که نقش مفیدی برای ارگانیسم ها دارند. در غلظت‌های کم-متوسط، ROS ها برای فعالیت‌های فیزیولوژیکی مانند سیگنال‌دهی داخل سلولی و هموستاز، مرگ سلولی، دفاع ایمنی در برابر پاتوژن‌ها و القای پاسخ میتوژنیک مورد نیاز هستند. این رادیکال های آزاد به صورت درون سلولی به عنوان یک محصول جانبی متابولیسم طبیعی سلولی تولید می شوند. علاوه بر این، آنها می توانند توسط منابع بیرونی مانند نور UV، اشعه یونیزان، سبک زندگی، رژیم غذایی، استرس و سیگار القا شوند. حفظ تعادل بین حالت های احیا کننده و اکسید کننده برای عملکردهای فیزیولوژیکی مناسب بسیار مهم است. بنابراین، موجودات زنده به سیستم های دفاعی آنتی اکسیدانی، متشکل از آنتی اکسیدان های آنزیمی و غیر آنزیمی، برای تنظیم سطوح این رادیکال های آزاد مجهز هستند.

عدم تعادل بین تولید ROS و توانایی سیستم های آنتی اکسیدانی برای سم زدایی این واسطه های واکنشی منجر به استرس اکسیداتیو می شود. رادیکال‌های آزاد تولید شده در مقادیر بالا و غیرقابل کنترل، باعث آسیب به DNA، پروتئین‌ها و لیپیدها می‌شوند که می‌تواند به شدت سلامت سلول را به خطر بیندازد و به پیشرفت بیماری کمک کند. تحقیقات زیادی در سال های گذشته نشان داده‌اند که استرس اکسیداتیو در فرآیند طبیعی پیری و همچنین طیف گسترده‌ای از بیماری‌های انسانی، از جمله اختلالات نورودژنراتیو، مالتیپل اسکلروزیس(MS)، بیماری‌های قلبی عروقی، آرتریت روماتوئید و سرطان نقش دارد.

بر اساس ارتباط بین استرس اکسیداتیو و بیماری های انسانی، مطالعات متعددی نشان داده اند که افزایش دریافت آنتی اکسیدان در رژیم غذایی، خطر ابتلا به بیماری های عروقی کرونر قلب، بیماری آلزایمر، پارکینسون، سکته مغزی ایسکمیک و آسم را کاهش می دهد.

بنابراین، نشانگرهای زیستی استرس اکسیداتیو ابزارهای مهمی در ارزیابی وضعیت بیماری و اثرات آنتی‌اکسیدان‌ها در تقویت سلامت انسان هستند.

مطالب پیشنهادی: مکانیسم اکسیدان ها و آنتی اکسیدان هاانواع آنتی اکسیدان ها و رادیکال های آزاد

تاثیر ROS در بدن

گونه های فعال اکسیژن (ROS)، مولکول های کلیدی مسئول اثرات مضر استرس اکسیداتیو هستند. اندازه گیری مستقیم سطوح سلولی آن ها یکی از رویکردهای تعیین شرایط استرس اکسیداتیو است.

اندازه گیری مستقیم سطح استرس اکسیداتیو و ROS

یک راه برای تخمین سطوح سلولی ROS از طریق استفاده از پروب های فلوروژنیک است. پراکسید هیدروژن (H2O2)، رادیکال های هیدروکسیل (OH-)، و رادیکال های پراکسیل (ROO-) می توانند به دنبال رنگ آمیزی با ۵ و ۶ کربوکسی-۲’، ۷′-دی کلرودی هیدروفلورسئین دی استات (DCFDA) اندازه گیری شوند. این پروب نفوذ پذیر به غشا به داخل سلول ها پخش می شود و در آنجا توسط استراز درون سلولی به DCFH هیدرولیز می شود. DCFH در داخل سلول ها به دام می افتد و با H2O2 واکنش می دهد و (DCF) 2′,۷′-dichlorofluorescein را تولید می کند. بنابراین، مقدار پراکسید تولید شده توسط سلول‌ها را می‌توان با شدت فلورسانس DCF (تحریک = ۴۸۸ نانومتر و انتشار = ۵۳۰ نانومتر) که توسط فلوسیتومتری یا با استفاده از پلیت ریدر فلورسانس تجزیه و تحلیل می‌شود، تخمین زد.

مطالب پیشنهادی: اندازه گیری آنتی اکسیدان و رادیکال های آزاد به وسیله ی تکنیک الایزا

از سوی دیگر، مولکول های سوپراکسید (O2-) را می توان با رنگ آمیزی توسط یک پروب فلورسنت دیگر، دی هیدرواتیدیوم (DHE) شناسایی کرد. شکل احیا شده بوروهیدرید سدیم اتیدیوم بروماید نیز برای سلول های زنده نفوذپذیر است. در داخل سلول ها، DHE به طور مستقیم توسط آنیون سوپراکسید به اتیدیوم بروماید اکسید می شود، که سپس فلورسانس می گردد. فلورسانس قرمز، با استفاده از طول موج جذبی ۴۸۸ نانومتر و طول موج نشری ۵۸۵ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود که شدت آن، متناسب با سطوح آنیون سوپراکسید درون سلولی در نظر گرفته می‌شود.

 روش دیگر برای تعیین کمیت مولکول‌های ROS مانند هیدروپراکسیدها (R-OOH)، به ‌ویژه در سرم، ارزیابی مشتقات آزمایش متابولیت‌های اکسیژن فعال (D-Roms) است. در این روش، مقدار کمی از سرم بیمار در یک محلول بافر استات حل می شود (PH ۴.۸). یون‌های فلزات واسطه (Fe2+، +Fe3)، آزاد شده از پروتئین‌های موجود در محیط اسیدی، با گروه‌های هیدروپراکسید واکنش می‌دهند و آنها را از طریق واکنش فنتون به رادیکال‌های آلکوکسی (R-O•) و پراکسی (R-OO•) تبدیل می‌کنند. این رادیکال های تازه تشکیل شده، توسط یک کروموژن (N، N-دی اتیل-پارا فنیل دی آمین) به دام می افتند که منجر به تشکیل کاتیون رادیکال مربوطه می شود. غلظت این رادیکال‌های تازه تشکیل‌شده، که مستقیماً با غلظت پراکسیدهای موجود در سرم متناسب است، با روش‌های اسپکتروفتومتری با جذب ۵/۵ نانومتر تعیین می‌شود.

کیت های سنجش میزان استرس اکسیداتیو ROS

اندازه گیری مستقیم سطوح ROS با دقت بسیار بالا به دلیل طول عمر کوتاه و واکنش سریع آنها با اجزای تنظیم کننده حالت ردوکس سلول دشوار می باشد. از آنجا که رادیکال های پراکسیل و پراکسید هیدروژن مولکول های نسبتاً پایداری هستند (با نیمه عمر از ثانیه تا دقیقه) و رادیکال های هیدروکسیل بسیار واکنش پذیر هستند (نیمه عمر کمتر از یک نانوثانیه دارند) . بنابراین، اندازه‌گیری غیرمستقیم ROS با بررسی آسیب اکسیداتیو این رادیکال‌ها به لیپیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک در سلول ها رویکردی جایگزین و مناسب برای ارزیابی استرس اکسیداتیو در نمونه‌های بالینی است.

خدمات مرتبط: انجام تکنیک الایزا و وسترن بلات با بانکی غنی از انواع آنتی بادی

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

هجده − ده =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا