سلولی

بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی – بخش سوم

بررسی استرس اکسیداتیو سلولی با آنتی اکسیدان های آنزیمی و غیر آنزیمی

هموستاز ردوکس توسط دو مکانیسم آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی تنظیم می شود.

آنتی اکسیدان های آنزیمی

سوپر اکسید دیسموتاز

سوپراکسید دیسموتاز (SOD) خانواده ای از آنزیم های آنتی اکسیدانی است که سطح ROS را با کاتالیز کردن تبدیل سوپراکسید به پراکسید هیدروژن و اکسیژن مولکولی تنظیم می کند. در یکی از روش های تعیین فعالیت SOD، اساس روش توانایی SOD برای مهار خود اکسیداسیون آدرنالین به آدرنوکروم در یک محیط پایه است که می تواند در جذب λ = ۴۸۰nm اندازه گیری شود. روش دیگری برای اندازه گیری مستقیم فعالیت SOD است. به جای اتوکسیداسیون اپی نفرین، روش توانایی SOD برای مهار خود اکسیداسیون پیروگالول به یک محلول زرد رنگ است که می تواند در جذب ۴۲۰ نانومتر اندازه گیری شود.

بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی

از طرف دیگر، فعالیت SOD را می توان به شکل غیر مستقیم اندازه گیری کرد. در این روش، رادیکال های سوپراکسید تولید شده توسط سیستم NADH/D-آمینه اسید اکسیداز-فنازین متوسولفات (PMS) یا سیستم گزانتین-گزانتین اکسیداز، باعث ایجاد کاهش نمک های تترازولیوم مانند ۲-(۴-ایدوفنیل) ۳-(۴-نیتروفنول)-۵-فنیل تترازولیوم (INT)، ۳-{ ۱-[(فنیلامین)- کربونیل]-۳،۴-تترازولیوم}-bis (4-متوکسی-۶-نیترو) بنزن سولفونیک اسید (XTT)، یا نیترو تترازولیوم آبی (NBT)، به فرمازان آبی می شود که با روش اسپکتروفتومتری در ۴۷۰-۵۶۰ نانومتر اندازه گیری شود. SOD در نمونه ها با رادیکال های سوپراکسید تولید شده رقابت می کند.، در نتیجه واکنش کاهش تترازولیوم را مهار می کند.

آنزیم کاتالاز

کاتالاز یک آنزیم آنتی اکسیدانی است که مسئول تجزیه پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن است. روش های متعددی برای ارزیابی فعالیت این آنتی اکسیدان در نمونه های بیولوژیکی طراحی شده است. یک روش طیف سنجی کمی، از تجزیه پراکسید هیدروژن کاتالیز شده توسط کاتالاز، با مشاهده کاهش جذب ماوراء بنفش محلول پراکسید هیدروژن به عنوان تابعی از زمان در طول موج ۲۴۰ نانومتر پیروی می کند.

روش رنگ سنجی ساده دیگری بر اساس استفاده از پراکسید هیدروژن توسط کاتالاز با استفاده از معرف K2Cr2O7/اسید استیکمی باشد. هنگامی که در حضور پراکسید هیدروژن گرم می شود، با گرم شدن دی کرومات در حضور هیدروژن پراکسید، دی کرومات موجود در اسید استیک به استات کروم کاهش می یابد که می تواند به صورت رنگ سنجی در طول موج ۶۱۰ نانومتر اندازه گیری شود . در هر دو این روش، فعالیت کاتالاز با ناپدید شدن پراکسید هیدروژن تعیین می شود و بنابراین هر واحد به عنوان مقداری تعریف می شود که ۱ میکرومول پراکسید هیدروژن را در دقیقه تجزیه می کند.

آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز

گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) آنزیم آنتی اکسیدانی دیگری است که احیای پراکسید هیدروژن و پراکسیدهای لیپیدی به آب و الکل های لیپیدی مربوط به آنها را از طریق اکسیداسیون گلوتاتیون احیا شده (GSH) به گلوتاتیون دی سولفید (GSSG) کاتالیز می کند که در آن نمونه ها با پراکسید هیدروژن در حضور گلوتاتیون برای یک دوره زمانی خاص انکوبه می شوند. سپس مقدار پراکسید هیدروژن استفاده شده با تخمین مستقیم محتوای GSH با استفاده از معرف Ellman، اسید ۵،۵′-دی تیوبیس نیتروبنزوئیک (DTNB) تعیین می شود.

بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی

در روش دیگر، GPx ، اکسیداسیون گلوتاتیون را توسط کومن هیدروپراکسید (cumene hydroperoxide) (برای GPx مستقل از سلنیوم) یا پراکسید هیدروژن (برای GPx وابسته به سلنیوم) کاتالیز می کند. در این روش، گلوتاتیون اکسید شده توسط گلوتاتیون ردوکتاز اگزوژن کاهش می یابد و باعث می شود که کوآنزیم واکنش، NADPH، به NADP+ اکسید شود. سپس تغییر در جذب را می توان به صورت طیف سنجی در λ = ۳۴۰ نانومتر خوانش کرد.

مطالب پیشنهادی: مکانیسم اکسیدان ها و آنتی اکسیدان ها – انواع آنتی اکسیدان ها و رادیکال های آزاد

گلوتاتیون S- ترانسفرازها

گلوتاتیون S- ترانسفرازها (GSTs) اعضایی از خانواده چند ژنی ایزوآنزیم ها هستند. تعدادی از ایزوآنزیم های GST علاوه بر نقش کاتالیزوری خود در ترکیب GSH با انواع ترکیبات الکتروفیل مضر برای سم زدایی، هیدروپراکسیدهای لیپیدی را از طریق فعالیت GPx مستقل از سلنیوم کاهش می دهند و محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدی مانند ۴-HNE را سم زدایی می کنند. فعالیت آنها بر اساس توانایی GST برای ترکیب ۱-کلرو-۲،۴-دینیتروبنزن (CDNB) به گلوتاتیون احیا شده است. این کونژوگه با افزایش جذب در طول موج ۳۴۰ نانومتر همراه است که می تواند به صورت اسپکتروفتومتری اندازه گیری شود تا به طور مستقیم سطح فعالیت GST را تخمین بزند.

روش های غیر آنزیمی

بررسی ظرفیت آنتی اکسیدانی کل

سابقا در تحقیقات، بررسی وضعیت آنتی اکسیدان ها با اندازه گیری سطوح یا فعالیت های هر یک از آنتی اکسیدان ها به طور جداگانه انجام می شد. با این حال، اندازه گیری اثر کلی آنتی اکسیدان ها می تواند در ارزیابی حالت اکسیداتیو در نمونه های بالینی به دلیل برهمکنش های مختلف بین آنتی اکسیدان های مختلف بسیار مفید باشد. به این منظور روش تعیین وضعیت آنتی‌اکسیدانی کل (TAS) در نمونه‌های بالینی ایجاد شده‌ است.

سنجش کاهش ۲،۲-دی فنیل-۱-پیکریل هیدرازیل (DPPH) روشی است که از تله های رادیکال آزاد برای ارزیابی ظرفیت آنتی اکسیدانی نمونه ها استفاده می کند. DPPH یک رادیکال آزاد پایدار است که به دلیل جابجایی الکترون اضافی روی مولکول است، با رنگ بنفش پر رنگ در طول موج جذبی ۵۲۰ نانومتر مشخص می شود. هنگامی که DPPH با یک ترکیب ضد رادیکال که می تواند آن را خنثی کند مخلوط شود، بی رنگ می شود. بنابراین، کاهش چگالی نوری رادیکال‌های DPPH برای ارزیابی پتانسیل آنتی‌اکسیدانی نمونه‌ها بررسی می‌شود.

مطالب پیشنهادی: اندازه گیری آنتی اکسیدان و رادیکال های آزاد به وسیله ی تکنیک الایزا

سنجش قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده آهن (FRAP) روش ساده تر و سریعتر برای ارزیابی پتانسیل آنتی اکسیدانی پلاسما می باشد. با این حال، این روش نمی تواند آنتی اکسیدان هایی را که با خاموش کردن رادیکال عمل می کنند، شناسایی کند. سنجش های رنگ سنجی بر اساس توانایی آنتی اکسیدان ها برای کاهش کمپلکس تری پیریدیل تریازین آهن (Fe3+-TPTZ) به فرم آهنی در pH پایین است. محصول نهایی (Fe2+-TPTZ) دارای رنگ آبی شدید با جذب در طول موج ۵۹۳ نانومتر است که می‌توان با استفاده از طیف‌سنج آرایه‌ای دیودی، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی نمونه‌ها را ارزیابی کرد.

تست پتانسیل آنتی اکسیدانی بیولوژیکی (BAP) سنجش دیگری بر اساس توانایی آنتی اکسیدان ها در کاهش یون های فریک (ferric) به یون های ferrous است. با این حال، در این روش، یون‌های ferric به یک بستر مشتق از تیوسیانات کروموژنیک متصل می‌شوند که وقتی یون‌های ferric توسط آنتی‌اکسیدان‌های نمونه سرم به یون‌های ferrous تبدیل می‌شوند، بی رنگ می شوند. این کاهش برای تخمین ظرفیت آنتی اکسیدانی نمونه با اندازه‌گیری تغییر جذب در ۵۰۵ نانومتر تعیین می‌شود.

مطالب مرتبط: بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی – بخش دومبررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی – بخش اول
خدمات مرتبط: انجام تکنیک الایزا و وسترن بلات با بانکی غنی از انواع آنتی بادی

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

سیزده − هشت =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا