بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی – بخش دوم

روش های غیر مستقیم سنجش ROS

آسیب اکسیداتیو به پروتئین

محتوای پروتئین کربونیل (PC) یک نشانگر (مارکر) رایج برای تغییرات اکسیداتیو پروتئین ها است که شواهد قابل توجهی از میزان استرس اکسیداتیو در نمونه های بالینی ارائه می دهد. گروه های کربونیل پروتئین ها به دلیل اکسیداسیون اسیدهای آمینه مانند پرولین، آرژنین، لیزین و ترئونین توسط مولکول های ROS تولید می شوند. پروتئین های اکسید شده را می توان با استفاده از روش ۲،۴-دی نیتروفنیل هیدرازین (DNPH) که توسط لوین و همکارانش ارائه شده است، اندازه گیری کرد. در این سنجش، DNPH با گروه های کربونیل پروتئین ها واکنش می‌دهد، و یک شیف باز برای تولید محصولات دی‌نیتروفنیل هیدرازون (۲,۴-dinitrophenylhydrazone) تولید می کند، که سطوح آن را می‌توان به صورت اسپکتروفتومتری در طول موج جذبی ۳۷۵ نانومتر اندازه گیری کرد که شدت آن، متناسب با سطوح پروتئین‌های اکسید شده مرتبط است همچنین، محتویات PC را می توان با الکتروفورز ژل ۲ بعدی و وسترن بلات شناسایی کرد.

تعیین میزان محصولات پروتئین اکسیداسیون پیشرفته (AOPP)

تعیین میزان محصولات پروتئین اکسیداسیون پیشرفته (AOPP)، رویکرد دیگری برای ارزیابی اکسیداسیون پروتئین در نمونه‌های بالینی است. AOPP که به عنوان محصولات پروتئینی دارای کراس لینک حاوی دی تیروزین نیز تعریف می شود، از طریق واکنش پروتئین های پلاسما با اکسیدان های کلردار مانند کلرامین ها تولید می شود. در این روش، پلاسما یا سرم بیماران که با کلرامین-T کالیبر می شود، با یدید پتاسیم و اسید استیک مخلوط می‌شود و میزان جذب به صورت اسپکتروفتومتری در طول موج ۳۴۰ نانومتر خوانده می‌شود.

مطالب پیشنهادی: مکانیسم اکسیدان ها و آنتی اکسیدان ها – انواع آنتی اکسیدان ها و رادیکال های آزاد

آسیب اکسیداتیو به لیپید

آسیب لیپیدی پراکسیداسیون لیپیدی معمولاً به عنوان شاخص آسیب ناشی از ROS به غشای سلولی استفاده می شود. مالون دی آلدئید (MDA) یکی از بهترین محصولات نهایی مورد مطالعه پراکسیداسیون اسیدهای چرب اشباع نشده در نمونه های بالینی است و اغلب برای تخمین شرایط استرس اکسیداتیو استفاده می شود. سطوح MDA را می توان با استفاده از مواد واکنش دهنده اسید تیوباربیتوریک (TBARS) اندازه گیری کرد. در تمام این روش‌ها، MDA با TBARS در محیط اسیدی در دمای ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد واکنش می‌دهد تا یک محصول صورتی-قرمز رنگ تولید کند که می‌توان آن را با بوتانول استخراج کرد و با استفاده از یک اسپکتروفتومتر با جذب ۵۲۰-۵۳۵ نانومتر یا توسط فلورومتر در طول موج جذبی تحریک = ۵۱۵ نانومتر و طول موج نشری = ۵۵۵ نانومتر اندازه گیری کرد. روش TBARS سریع و آسان است. با این حال، آلدئیدهای غیر از MDA نیز ممکن است با TBARS واکنش دهند و مشتقاتی تولید کنند که نور را در محدوده طول موج یکسان جذب می کنند.

روش دیگر، MDA پلاسما را می توان با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) با استفاده از ستون فاز معکوس C18 یا با کروماتوگرافی گازی – طیف سنجی جرمی (GC-MS) روی یک ستون مویرگی به دنبال ترانس متیلاسیون با متوکسید سدیم اندازه گیری کرد. در حالی که این روش سطوح MDA را به صورت تکرار پذیرتر و قابل اعتمادتر تعیین می کند، پردازش نمونه فردی آن را زمان بر و غیرعملی می کند.

آسیب اکسیداتیو DNA

۸-هیدروکسی-۲′-دئوکسی گوانوزین (۸-OHdG) یکی از تغییرات اکسیداتیو در DNA است که توسط هیدروکسیلاسیون بازهای دئوکسی گوانوزین ایجاد می شود. ۸-OHdG را می توان با سیستم های ترمیم آنزیمی از DNA جدا کرد که منجر به گردش آنها در خون و دفع از طریق ادرار می شود. بنابراین، سطوح ۸-OHdG در خون و یا ادرار بیماران را می توان به عنوان نشانگر آسیب اکسیداتیو DNA اندازه گیری کرد. ۸-OHdG غالباً با استفاده از HPLC توسط یک آشکارساز الکتروشیمیایی (ECD) بررسی می‌شود.

با وجود حساسیت و دقت، روش HPLC-ECD به دلیل هزینه، دخالت فنی و توان عملیاتی کم، برای تجزیه و تحلیل محتوای ۸-OHdG در نمونه‌های بالینی بسیار راحت نیست. روش‌های جایگزین و ساده‌تر برای اندازه‌گیری این نشانگر آسیب DNA شامل سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA)، و تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی است. ۸-oxodG همچنین می تواند با اتصال کونژوگه OxyDNA-FITC و سپس آنالیز توسط فلوسیتومتری برای فلورسانس درطول موج جذبی = ۴۹۵ نانومتر و طول موج نشری = ۵۱۵ نانومتر شناسایی شود.

بررسی وضعیت آنتی اکسیدانت

بدن انسان مجهز به یک سیستم آنتی اکسیدانی است که برای مقابله با اثرات مضر رادیکال های آزاد اکسیداتیو عمل می کند. هنگامی که تعادل بین آنتی اکسیدان ها و گونه های ROS، که به آن هموستاز ردوکس گفته می شود، مختل شود، استرس اکسیداتیو می تواند رخ دهد.

اختلال در این تعادل پرواکسیدانی و آنتی اکسیدانی می تواند در نتیجه افزایش تولید رادیکال آزاد، غیرفعال شدن آنزیم آنتی اکسیدانی یا مصرف بیش از حد آنتی اکسیدان باشد. بنابراین، وضعیت آنتی اکسیدانی می تواند با میزان استرس اکسیداتیو در نمونه های بالینی مرتبط باشد.

مطالب مرتبط: بررسی میزان استرس اکسیداتیو ROS سلولی – بخش اول – اندازه گیری آنتی اکسیدان و رادیکال های آزاد به وسیله ی تکنیک الایزا
خدمات مرتبط: انجام تکنیک الایزا و وسترن بلات با بانکی غنی از انواع آنتی بادی