آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی گیمسا (Giemsa) در آزمایشگاه بافت شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه‌ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا در بافت‌شناسی

رنگ آمیزی گیمسا یکی از چندین رنگ های هماتولوژی معروف به رنگ‌های رومانوفسکی است که ساختارهای مختلف سلولی را متمایز می کند و باکتری ها را در اسمیر خون تشخیص می دهد. گیمسا یک تکنیک چند رنگی شامل رنگ های اسیدی (ائوزین و آزور B) و بازی (رنگ پایه متیلن بلو) است. رنگ های بازی بخش های اسیدی سلول را رنگ آمیزی و رنگ های اسیدی اجزای بازی سلول مانند سیتوپلاسم و گرانولها را رنگ می‌کند. دو ترکیب مختلف رنگ های رومانوفسکی (Romanowski ) سبب تفکیک دقیق سلول‌ها، طیف رنگی و مجزا نمودن گرانول های سلول با رنگ های تفکیکی می شود. از انواع رنگ های رومانوفسکی می توان به رنگ رایت، گیمسا، لیشمن اشاره نمود که متداول ترین آنها در آزمایشگاه پاتولوژی و هماتولوژی، رنگ آمیزی گیمسا می باشد.

تاریخچه رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا

گوستاو گیمسا (Gustav Giemsa )، شیمیدان آلمانی که این تکنیک رنگ آمیزی به نام او نامگذاری شده است، در سال ۱۹۰۲ میلادی برای اولین بار این روش رنگ آمیزی گیمسا را جهت نشان دادن انگل های عامل مالاریا توسعه داد. رنگ گیمسا می تواند به طور موثر نقاط شوفنر یا نقاط رنگی در نمونه خون شناسی (Schüffner’s dots) را نشان دهد، که به انگل مالاریا(Plasmodium vivax) وابسته هستند. اینها با رنگ رایت-گیمسا (Wright-Giemsa) تشخیص داده نمی شوند، بنابراین امروزه گیمسا به عنوان روش استاندارد طلایی برای تشخیص مالاریا در نظر گرفته می شود.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا در بافت شناسی

مطالعه و بررسی سلول‌های خونی و تشخیص انگل مالاریا: علاوه بر تکنیک رنگ آمیزی رایت (Wright’s Stain) جهت مطالعه خون محیطی، رنگ گیمسا نیز استفاده می شود. رنگ آمیزی لام خون محیطی و تشخیص انگل مالاریا از جمله کاربردهای جهانی رنگ گیمسا است. تشخیص زودهنگام انگلی مالاریا سنگ بنای درمان و کنترل مالاریا است. اگرچه تست های تشخیصی سریع مالاریا به طور فزاینده ای مورد استفاده قرار می گیرند، اما بررسی میکروسکوپی آن همچنان استاندارد مرجع برای تشخیص مالاریا است. علاوه بر مقرون بصرفه بودن تست، مزیت رنگ آمیزی گیمسا ارزیابی کمی از انگل خون محیطی و مراحل زندگی انگل و همچنین اطلاعات در مورد سایر عناصر خونی را ارائه می دهد.

این رنگ آمیزی همچنین برای تشخیص پارازیت تریکوموناس تروفوزوئیت (Trophozoite Trichomonas) عامل بیماری جنسی مقاربتی تریکومونیازیس، در نمونه های مایع مخاطی کاربرد دارد.
تشخیص نمونه آلوده به باکتری: در نمونه های بیوپسی معده جهت تشخیص باکتری هلیکوباکتر پیلوری (H.pylori) از رنگ آمیزی گیمسا استفاده می شود. همچنین می توان از این رنگ افتراقی برای مطالعه چسبیدن باکتری‌های بیماری‌زا به سلول‌های انسانی استفاده کرد. سلول‌های انسانی و باکتریایی را به رنگ بنفش و صورتی رنگ می-کند.
تشخیص و بررسی بدخیمی‌های خونی: مطالعه و تشخیص برخی از انواع بدخیمی‌های خونی در نمونه هایپرسلولار مغز استخوان رنگ شده با گیمسا نیز انجام می شود.

نگاهی اجمالی به خون و سلول‌های خونی رنگ شده با گیمسا

خون مایع تخصصی بدن است، دارای چهار جزء اصلی شامل: پلاسما، گلبول‌های قرمز، گلبول‌های سفید و پلاکت‌ها. خون عملکردهای مختلفی دارد، از جمله: انتقال اکسیژن و مواد مغذی به بافت های بدن، تشکیل لخته های خون برای جلوگیری از دست دادن خون اضافی، حامل سلول ها و آنتی بادی هایی که در سیستم ایمنی بدن ایفای نقش می‌کنند، تصفیه خون و تنظیم دمای بدن.

گلبول های سفید خون به نام لکوسیت شامل دو گروه فاگوسیت ها و لنفوسیت ها هستند. در حالی که فاگوسیت ها سلول‌های سیستم ایمنی ذاتی را تشکیل می‌دهند و پس از عفونت به سرعت عمل می‌کنند، لنفوسیت‌ها واسطه پاسخ ایمنی اکتسابی هستند. خود فاگوسیت ها را می توان به گرانولوسیت ها (نوتروفیل ها، بازوفیل ها و ائوزینوفیل ها) و مونوسیت ها تقسیم کرد. با افزایش یا کاهش تعداد گلبول های سفید خون بیماریهایی بروز می کنند. به عنوان مثال در بیماری های آلرژیک تعداد بازوفیل ها افزایش می یابد یا در بدخیمی های خونی می توان شاهد افزایش تعداد پیش سازهای سلول های خونی و تغییر شکل و اندازه آنها بود. در دو دهه اخیر، تکنیک‌های تصویربرداری خودکار از لام های حاوی اسمیر خون توسط میکروسکوپ‌های متصل به کامپیوتر که قادر به ارزیابی مورفولوژی سلول‌های خونی هستند، معرفی شده‌اند. با پیشرفت تکنولوژی امکان افتراق تعداد سلول های خونی طبیعی از غیر طبیعی فراهم شده است.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا

طیف گسترده‌ای از نمونه‌های بافتی و مایعات بدن قابلیت رنگ‌آمیزی با گیمسا را دارند. از جمله این نمونه ها می توان به نمونه های خون تازه یا ضد انعقادی در EDTA، مغز استخوان، خلط، ادرار، بیوپسی آسپیراسیون از مغز استخوان، برش‌های بافتی تازه، فیکس شده با پارافین مثل بیوپسی معده، بافت دستگاه تولیدمثل، گره‌های لنفاوی یا بافت لنفوئید، نمونه طحال و لوزه اشاره نمود.

در این مقاله به یک مورد از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی گیمسا می‌پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا در بافت‌شناسی

در رنگ‌آمیزی گیمسا، رعایت دقیق دستورالعمل‌ها برای به دست آوردن نتایج قابل اعتماد با ساختارهای سلولی بسیار متمایز، مهم است. روش های رنگ آمیزی اسمیر خون و مقاطع بافتی دارای یک سری تفاوت‌ها هستند که در اینجا نیز شرح داده می شوند.

مراحل آماده سازی نمونه بافتی در رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا

هنگامی که نمونه مورد بررسی بخشی از بافت است ابتدا می بایست بافت طی چندین مرحله فیکس و برش زده می شود.

1. آبگیری بافت: مرحله آبگیری بافت اولین مرحله پروتکل، پس از تحویل نمونه به آزمایشگاه است که نمونه های بافتی در اتانول غوطه‌ور می شوند. اتانول جایگزین آب در سلول‌های نمونه بافتی می شود. از افزایش غلظت اتانول (معمولاً از ۷۰ تا % ۱۰۰) در این مراحل استفاده می‌شود.
2. قالب‌گیری بافت: پس از آبگیری، پارافین مذاب با دستگاه پارافین دیسپنسر در تیشوبسکت ها می ریزیم. تکه های بافت را در تیشوبسکت حاوی پارافین مذاب قرار داده و قالب‌گیری کرده و اضافه های پارافین را حذف می‌کنیم نهایتا بلوکهای پارافینی جامد از بافت داریم. پارافین که منجمد شد می بایست آن را از قالب جدا کنیم.
3. برش‌گیری از بلوک پارافینی: در این مرحله از نمونه پارافینی با دستگاه میکروتوم برشهای نازک در حد کمتر از ۱۰ میکرون تهیه می کنیم. چندین برش اولیه را دور می‌ریزیم و از سطح مقطع میانی بافت برش تهیه می‌کنیم.
4. آبدهی نمونه برش زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و سپس پارافین‌های اضافی نمونه‌ها را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم تا برش بافتی صاف و بدون چروکیدگی روی لام قرار گیرد و نهایتا با غلظت های مختلف از اتانول (غلظت زیاد به کم) نمونه ها را آبدهی می‌کنیم.
5. هنگامی که نمونه موردنظر، خون باشد نیازی به انجام مراحل ذکر شده نیست و می بایست اسمیری از نمونه خون روی لام تهیه کنیم و اجازه دهیم اسمیر در محیط آزمایشگاه خشک شود و سپس رنگ‌آمیزی را انجام دهیم.
6. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی پاپ رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا

1. جهت تهیه استوک اصلی گیمسا، ۷.۶ گرم از پودر رنگ گیمسا را به ظرف تیره حاوی ۵۰۰ سی سی متانول اضافه نموده و ۵۰۰ سی سی گلیسیرین را به آن اضافه کرده و ظرف را در آون با دمای ۳۷ درجه یا روی شیکر قرار می‌دهیم تا رنگ به آرامی حل شود و پس از آن محلول رنگی را با کاغذ صافی واتمن فیلتر کرده و در محیط آزمایشگاه (۱۸-۲۶ درجه سانتی گراد) نگهداری می کنیم. مقادیر دقیق مواد جهت تهیه استوک بر اساس پروتکل سازنده پودر گیمسا و ستاپ آزمایشگاه انجام دهنده می‌باشد.
2. اگر گیمسا بصورت محلول در دسترس باشد طبق پروتکل تولید کننده، جهت تهیه working solution تازه رقیق سازی انجام می شود. عمدتا ترکیبات رنگ گیمسا شامل رنگ متیلن بلو، متانول و پایدارکننده (Stabilizer) می باشد.
3. رنگ آمیزی گیمسا را می توانیم طبق دو پروتکل با نام های استاندارد و سریع( Rapid) انجام دهیم. تفاوت این دو پروتکل در غلظت های محلول رنگی گیمسا است. در پروتکل استاندارد، working solution 3 درصد از استوک اصلی رنگ تهیه می‌کنیم و در پروتکل رپید یا سریع، با working solution 10 درصد کار می کنیم.
4. لام‌های حاوی نمونه های برش زده را ۵ الی ۷ دقیقه در متانول قرار می دهیم تا نمونه روی لام فیکس شود. متانول بعنوان فیکساتور اجازه تغییر بیشتر در سلولها را نمی دهد و سبب چسبیدن سلولهای نمونه مورد بررسی به لام می گردد.
   
   نکته: اگر نمونه مورد نظر خون باشد نیازی به انجام مرحله فیکس کردن نمی باشد.
5. لام‌ها را در رک لام میکروسکوپی قرار داده و در محیط آزمایشگاه قرار می دهیم تا با جریان هوا خشک شوند.
6. لام‌ها را به مدت ۴۵ الی ۶۰ دقیقه در محلول رنگ گیمسا با غلظت ۳% قرار می‌دهیم. برای غلظت ۱۰ درصد گیمسا، لام ها را ۱۰ الی ۱۵ دقیقه با رنگ انکوبه می کنیم. مدت زمان این مرحله بستگی به غلظت محلول رنگ گیمسا دارد، هر چه غلظت بیشتر باشد زمان انکوبه لام در رنگ کمتر است.
7. بعد از سپری مدت زمان لازم، لام ها را در رک مخصوص لام قرار می دهیم و لام٬ها را با آب مقطر به مدت دو دقیقه شستشو می‌دهیم. pH آب در کلیه مراحل رنگ‌آمیزی گیمسا بسیار مهم است و می بایست ۷.۲ باشد.
8. اکنون نمونه های رنگ شده با گیمسا را می توانیم با میکروسکوپ نوری بررسی کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی گیمسا

مواد مورد نیاز

• پودر گیمسا
• متانول
• گلیسرین
• آب مقطر
• بافر PBS
• کاغذ صافی واتمن (Whatman filter paper)

تجهیزات مورد نیاز

• آون یا فور
• دستگاه میکروتوم
• شیکر
• دستگاه پارافین دیسپنسر
• لام و لامل
• تیشوبسکت
• رک لام میکروسکوپی

تفسیر نتایج رنگ آمیزی گیمسا

رنگ آمیزی گیمسا ترکیبی از رنگ‌های متیلن بلو و محصولات اکسیداتیو آن، آزور A و آزور B و رنگ اسیدی به نام ائوزین تشکیل شده است که منجر به تمایز اجزای مختلف سلولی و انواع سلولها با رنگ های متنوع در نمونه مورد مطالعه می‌شود.

گلبول‌های قرمز: صورتی
هسته‌های لکوسیت: آبی/بنفش
پلاکت‌هایی با سیتوپلاسم بنفش تیره حاوی گرانول‌های بنفش- قرمز
هسته سلول: آبی تیره
سیتوپلاسم لنفوسیت‌ها و مونوسیت‌ها: آبی کم رنگ
گرانولهای نوتروفیل: بنفش
گرانول ائوزینوفیل: نارنجی و صورتی
گرانول های بازوفیل: سیاه- بنفش
اریتروسیت ها: صورتی
بافت همبند: صورتی تا بنفش روشن

در تصویر زیر، رنگ آمیزی برشی به ضخامت ۲ میکرومتر از مغز استخوان انسان با گیمسا را نشان می‌دهد. ابتدا نمونه بافتی با ترکیب HCL/EDTA کلسیم زدایی شده است.

از رنگ آمیزی گیمسا در پاتولوژی، برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری در نمونه بیوپسی معده در پاتولوژی استفاده می‌شود. هلیکوباکتر پیلوری یک باکتری رایج معده انسان است و کلونیزاسیون طولانی مدت با ایجاد گاستریت آتروفیک، زخم معده و سرطان معده مرتبط است.

ارائه خدمات رنگ آمیزی اختصاصی پاپ اسمیر در آزمایشگاه بافت شناسی

گرچه دامنه تکنیک های آزمایشگاهی جهت مطالعه و بررسی انواع بافت های بدن موجودات گسترده است، اما اغلب دقیق-ترین و قابل استنادترین اما متداول ترین تکنیک‌های تحقیقاتی هستند که برای تشخیص و مطالعه انواع بیماری‌ها کارآمد هستند. از این رو بسیاری از تست های آزمایشی از جمله انواع رنگ‌آمیزی‌ها در آزمایشگاه بافت شناسی جزئی از همین تکنیک‌ها هستند.
آزمایشگاه پاتولوژی شرکت دانش‌ بنیان بافت و ژن پاسارگاد در حوزه تحقیقات بافت شناسی توانسته است یک پنلی از انواع تست های رنگ آمیزی مانند رنگ‌آمیزی اختصاصی گیمسا، تری‌کروم ماسون، اویل رد، گلژی، نقره و غیره برای مطالعه انواع نمونه های بیولوژیکی به دانشجویان، محققان و اساتید ارائه دهند. علاوه بر این نتایج حاصل از آنالیز را به همراه پروتکل‌های انجام تکنیک به محقق تحویل داده و همچنین فرصت شرکت در کارگاه های آموزشی رایگان و پاسخ به سوالات مرتبط با طرح پژوهشی برای محقق فراهم شده است.

جمع‌بندی

ارزش انواع رنگ‌ها و تست‌ها در پاتولوژی مدتهاست که تایید شده است، اما تعداد کمی از پاتولوژیست‌ها به دلیل مشکلات ستاپ رنگ‌ها و ترابلشوتینگ های روش انجام تکنیک، به طور مداوم در بخش‌های بافت‌شناسی موفق بوده‌اند. رنگ آمیزی گیمسا که سبب رنگ آمیزی افتراقی قابل تکرار برش های بافتی می شود به ویژه برای بررسی بافت های خون ساز مطلوب است. رنگ‌ گیمسا به علت توانایی برتر آن، در رنگ آمیزی مغز استخوان، پلاسماسل‌ها و ماست سل‌ها معمولاً در هماتولوژی و پاتولوژی استفاده می شود. همچنین برای شناسایی انگل های خونی بسیار مورد توجه است.

سوالات متداول

❔ رنگ آمیزی گیمسا برای تشخیص کدام میکروارگانیسم در خون استفاده می‌شود؟
✔️ رنگ آمیزی گیمسا تکنیکی استاندارد جهت تشخیص انگل مالاریا در اسمیرهای خونی کاربرد دارد.

❔ چند نوع رنگ در تکنیک رنگ آمیزی گیمسا کاربر دارد؟
✔️ گیمسا از یک رنگ پایه (متیلن بلو) برای رنگ‌آمیزی هسته‌ها و یک رنگ اسیدی (ائوزین) برای رنگ آمیزی اجزای سلول مانند سیوپلاسم تشکیل شده‌اند.