⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند
مقدمه‌ای از رنگآمیزی اختصاصی نقره در بافت‌شناسی
رنگآمیزی اختصاصی گلژی یا همان رنگآمیزی اختصاصی نقره شامل روش های متنوع رنگآمیزی است که بر اساس اصول مختلفی پایه گذاری شده است. پنج گروه از رنگهای نقره ای که توسط روشهای فیزیکوشیمی تعریف شده اند، در این نوع از رنگآمیزی دخیل هستند. این پنج دسته بندی عبارتند از روش های argentaffin، argyrophil، رنگ های impregnation، اکسیداسیون-کاهش نقره (silver oxidation-reduction) (رنگآمیزی قارچ، رتیکولوم و باکتری) ، برهمکنش های متالیک-متالیک. برای مثال سلولهای نورواندوکرین با تکنیک های argentaffin و argyrophil شناسایی شده در حالی که آکسونها، گره های عصبی فیبریلاری و پلاک های وابسته به پیری با تکنیک های اشباع نقره (impregnation) تشخیص داده می شود.
رنگآمیزی نقره از حساس ترین روشهای رنگ سنجی جهت تشخیص پروتئین و اسیدهای نوکلئیک در نمونه های بیولوژی است. این تکنیک شامل رسوب نقره فلزی روی سطح ژل در محل باندهای پروتئینی است. یونهای نقره (از نیترات نقره موجود در معرف رنگآمیزی) با گروه‌های عملکردی پروتئین خاصی برهمکنش داده و متصل می‌شوند.
تاریخچه رنگآمیزی اختصاصی گلژی
یافتن نقره نیترات جهت رنگآمیزی مواد ارگانیک به قرن ۱۲ میلادی برمی گردد اما استفاده از نقره نیترات از اواخر قرن ۱۹ در تحقیقات علمی گسترده تر شد. حدودا در همین زمان، استفاده از نقره در رنگآمیزی بافت شناسی مورد بررسی قرار گرفت. سپس در دهه ۱۹۷۰، Kerenyi و Gallyas این تکنیک را به عنوان روشی حساس جهت یافت مقادیر پروتئین ها با ژل معرفی کرده اند. رنگآمیزی کوماسی بلو معمولا برای یافتن باندهای پروتئینی تا ۵۰ نانوگرم کاربرد دارد در حالی رنگآمیزی نقره تا ۵۰ برابر این مقدار هم شناسایی می کند.
Camillo Golgi پاتولوژیست ایتالیایی رنگآمیزی نقره را برای مطالعه سیستم عصبی مرکزی ستاپ کرد. متد گلژی تعداد محدودی از سلولها را رنگآمیزی می کند. Camillo Golgi و Ramón y Cajal برنده جایزه نوبل به خاطر همکاری شان در نوروآناتومی با استفاده از روشهای رنگآمیزی نقره شدند. با تکنیک Golgi silver impregnation مورفولوژی سه بعدی سلولهای عصبی را نشان دادند. این متد بر اساس تشکیل رسوب های داخل سلولی مات نقره کرومات حاصل از برهمکنش دی کرومات پتاسیم و نقره نیترات می باشد. در سال ۱۸۷۳، Camillo Golgi نشان داد که بافت مغز به پتاسیم دی کرومات نسبت به نقره نیترات مقاومتر است به همین علت از نیترات نقره در رنگآمیزی استفاده شد و سبب انقلابی در نوروساینس و علوم اعصاب گردید. یک درصد کمی از نورون¬ها با نقره آغشته شدند و با کیفیت ترین جزئیات از آکسون و دندریتها قابل مشاهده گردید و و نهایتا ثابت شد که ساختار پایه ای سیستم عصبی مرکزی دندریت ها و آکسونها هستند.
انواع کاربردهای رنگآمیزی اختصاصی گلژی در بافت شناسی
این نوع از رنگآمیزی و نقره کاربردهای متنوع در آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی دارد. از جمله کاربردهای آن عبارتند از:
- کاربرد رنگآمیزی نقره در پاتولوژی: رنگآمیزی نقره روشی میکروسکوپی نوری برای تشخیص و ردیابی degeneration عصبی است که بر اساس حقیقتی که نورونهای در حال degeneration آرژیروفیل می شوند یعنی اینکه میل به ترکیب با نقره دارند. رنگآمیزی نقره در پاتولوژی با نام رنگآمیزی گلژی شناخته شده است که بیش از یک قرن است برای مشاهده و بررسی دقیق سلولهای عصبی مورد استفاده قرار گرفته است.
در این مقاله سعی بر این است به کاربرد رنگآمیزی نقره در پاتولوژی و نوروساینس پرداخته شود.
- کاربرد رنگ آمیزی نقره در بخش پروتئومیکس و ژنومیک: رنگآمیزی نقره به قابل رویت شدن هدفهای موردنظر از جزئیات داخل و خارج سلولی مانند DNA و پروتئین‌ها از جمله کلاژن نوع ۳ و فیبرهای رتیکولوم از طریق رسوب پارتیکل های نقره متالیک روی هدف ها با تکنیک ژل الکتروفورز کمک می کند. یونهای نقره از نقره نیترات با گروه های عملکردی پروتئین ها برهمکنش می دهند. قوی ترین برهمکنشها با گروه کربوکسیلیک اسید (Asp و Glu)، ایمیدازول (His)، آمین ها (Lys) پروتئین ها با یونهای نقره اتفاق می افتد. یافتن پروتئین ها در حد نانوگرم بر اساس الکتروفورز با رنگآمیزی نقره نیترات انجام می شود که در نهایت منجر به دقیق ترین بررسی سلول های مغزی، آکسون، دندریت، خارهای دندریتی (درخت زندگی) می باشد.
- کاربرد رنگ آمیزی نقره در میکروبیولوژی و قارچ شناسی: در تشخیص های میکروبیولوژی، جهت رنگآمیزی باکتری های متنوع مانند سودوموناس (Pseudomonas)، Legionella، Bartonella و Treponema و قارچ ها از قبیل Candida ، Cryptococcus، Pneumocystis. با استفاده از رنگ های نقره impregnation رنگآمیزی باکتری هایی انجام می شود که با روش های دیگر رنگآمیزی دیگر به سختی رنگآمیزی می شوند.
- کاربرد رنگ آمیزی نقره در آزمایشگاه ژنتیک پزشکی: کاربرد دیگر رنگآمیزی نقره در آزمایش کاریوتایپ می باشد. نقره نیترات پروتئین مناطق سازمان‌دهنده هسته ای NOR (Nucleolar organization region) رنگ می‌کند. کروموزوم‌های انسانی شماره ۱۳،۱۴،۱۵،۲۱ و ۲۲ ناحیه NOR را دارند. برخی از این پروتئین ها، پروتئین های غیر هیستونی نقره دوست (Ag-NOR proteins) هستند که به یه یونهای نقره متصل شده و سبب رسوب نقره در این نواحی می شود.
نگاهی اجمالی به دستگاه عصبی رنگ شده با نقره
دستگاه عصبی شامل مغز، نخاع، دستگاههای حسی و عصب های اندام های مختلف بدن می باشد. مغز و نخاع جز دستگاه عصبی مرکزی (CNS) و اعصاب و اندام های حسی جز دستگاه عصبی محیطی (PNS) محسوب می شوند. دستگاه عصبی محیطی اطلاعات را از مرکز کنترل به سمت عضلات، غدد و اندام‌ها هدایت کرده و عملکرد آنها را تنظیم می‌کنند. دستگاه عصبی از نورونها یا سلولهای عصبی و سلولهای نوروگلیا تشکیل شده است. مورفولوژی نورونها به علت داشتن زایده های سلولی بلند به نام آکسون نسبت به سلولهای دیگر بدن متفاوت است که با داشتن آنها در انتقال سیگنالهای الکتروشیمیایی به قسمت های مختلف بدن نقش دارند. سلولهای گلیال یا نوروگلیا به عنوان سلول کمک کننده در دستگاه عصبی ایفای نقش می کنند. هر سلول عصبی حدودا با ۱۰ تا ۶۰ سلول گلیال احاطه شده و در محافظت، تغذیه و عایق نورونها عمل می کند.
انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگآمیزی اختصاصی گلژی
تکنیک رنگآمیزی نقره و گلژی روی سلولهای عصبی بافت های سیستم عصبی مرکزی (مخ، مخچه) انجام می‌شود. نمونه های بافتی می‌تواند به صورت تازه (fresh)، فریز شده، فیکس شده با پارافین یا فرمالین از بخشی یا کل مغز باشد.
پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی گلژی در بافت‌شناسی
پروتکل های رنگآمیزی اختصاصی گلژی در پاتولوژی متنوع می باشند که اساس و پایه کلیه پروتکل ها یکسان است. در تست رنگآمیزی گلژی در سیستم عصبی غلظت ها و کیفیت مواد مورد استفاده بسیار مهم می باشد چرا که در این تست فقط تعداد اندکی از میان انبوه نورونها رنگآمیزی شده و در نتیجه سبب مطالعه دقیق موروفولوژی نورونها می شود.
در این مقاله به یکی از پروتکل های رنگآمیزی گلژی می پردازیم.
مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی گلژی
۱- استخراج و فیکس کردن بافت هدف: اولین مرحله انجام تست رنگآمیزی گلژی، آماده سازی نمونه بیولوژیکی است. آماده سازی و کیفیت نمونه در مطالعه موروفولوژی سلولهای عصبی نمونه هدف نقش مهمی ایفا می‌کند. منبع نمونه بافتی متنوع است که می تواند از روش بیوپسی، جراحی، مدل حیوانی و یا اتوپسی(autopsy) تهیه شده باشد. در سه نوع اول، بافت تازه را در اختیار پاتولوژیست قرار داده ولی در روش اتوپسی حداکثر تا دو ساعت بعد از مرگ موجود هدف، بافت تهیه می شود. بنابراین می بایست فوری بافت تهیه شده به روش اتوپسی را جهت جلوگیری از تجزیه آنتی‌ژن، فیکس کرد. بنابراین بافت مورد مطالعه می تواند فیکس شده با پارافین جامد، محلول فرمالدئید یا فریزشده باشد. اکثر بافت های مورد استفاده در تکنیک رنگآمیزی تازه (fresh) هستند.
نکته: اگر نمونه مورد مطالعه مغز کامل مثلا مغز رت باشد، می بایست پس از خارج کردن مغز از جمجمه، آن را با تیغ جراحی به قطعات ۵ الی ۱۰ میلی‌متر تقسیم کرده و سپس با آب مقطر به آرامی شستشو داده تا بافت عاری از خون گردد. بلوکهای بافتی با ضخامت کمتر از یک سانتی متر را در فرمالین ۱۰ درصد به مدت ۲۴ ساعت یا بیشتر انکوبه می کنیم.
۲- نمونه مورد نظر را در محلول اشباع( impregnation) تهیه شده در جار رنگ آمیزی حاوی کیت رنگآمیزی گلژی غوطه ور میکنیم و به مدت دو هفته در مکان تاریک و در دمای محیط انکوبه می کنیم. برای هر ۳ سانتی متر بافت مغز، حداقل ۵ سی سی از محلول اشباع در نظر می گیریم. محلول اشباع می بایست تازه تهیه شود.
روش دیگر بری این مرحله بدین صورت است که نمونه های بافتی را در پتاسیم بیکرومات ۳% به مدت ۳ تا ۷ روز در دمای محیط و در مکان تاریک انکوبه کرده و پس آن تیشو بسکت های حاوی نمونه ها را به محلول نقره نیترات انتقال داده و یک تا سه روز انکوبه می کنیم. کیفیت نقره نیترات و زمان انکوباسیون بسیار مهم می باشد و می بایست این زمان ستاپ شود.
۳- پس از ۲۴ساعت انکوبه، محلول اشباع استفاده شده را با محلول جدید جایگزین می کنیم و ظرف حاوی نمونه را کمی تکان می دهیم. بهتر است هر چند روز یک بار نمونه ها را به آرامی تکان دهید. مدت زمان انکوبه می تواند تحت تاثیر اندازه بافت قرار گیرد هر چه سایز بافت نمونه بزرگتر باشد، زمان انکوباسیون بیشتر می شود.
۴- اکنون نمونه‌های مغز درون تیشوبسکت ها را روی دستمال کاغذی قرار داده و سپس پارافین ذوب شده را در قالب ها می ریزیم به گونه ای که نمونه های مغز را بپوشاند و پس از بسته شدن پارافین، اضافه های آن را برش می زنیم.
۵- اکنون از قالب های پارافینی نمونه های مغز برش های نازک و با کیفیت با استفاده از دستگاه میکروتوم تهیه می کنیم.
۶- قطعات برش زده را به لام انتقال می دهیم. پس از چسبیدن برش بافت به لام، بایستی پارافین را از بافت جدا کنیم که نیاز به آبدهی بافت می باشد. مرحله آبدهی برعکس مرحله آبگیری انجام می شود. از غلظت های زیاد به کم اتانول استفاده می کنیم.
۷- لام ها را در زایلن به مدت ۵ دقیقه قرار می دهیم و سپس لام ها را دو مرتبه و هربار به مدت ۳ دقیقه در اتانول ۱۰۰ درصد و سپس یک بار و به مدت ۳ دقیقه در هر یک از غلظت های ۵۰ ، ۷۰ و ۹۵ اتانول قرار می دهیم. نهایتا اجازه می دهیم بافت ها به مدت یک شب در دمای اتاق خشک شوند.
مراحل رنگآمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی گلژی
- پس از خشک شدن لام ها، آنها را رنگآمیزی می کنیم. به این ترتیب که لام ها را دو مرتبه و هر بار به مدت ۵ دقیقه در آب دیونیزه انکوبه میکنیم.
- سپس در اتانول ۵۰ درصد به مدت ۵ دقیقه انکوبه میکنیم.
- اکنون لام ها را در محلول آمونیاک با نسبت ۱ به سه رقیق شده به مدت ۸ دقیقه قرار می دهیم.
- مجددا لام ها را دو مرتبه و هر بار به مدت ۵ دقیقه در آب دیونیزه غوطه ور می کنیم.
- لام ها را به مدت ۱۰ دقیقه و در مکان تاریک در سدیم تیوسولفات ۵ درصد غوطه ور کرده و پس از آن دو مرتبه و هر بار به مدت یک دقیقه با آب دیونیزه شست و شو می دهیم.
- به مدت ۶ دقیقه در هر کدام از غلظت های ۷۰%، ۹۵% و ۱۰۰% اتانول، لام ها شناور شده و نهایتا لام ها را به مدت ۵ دقیقه در زایلین انکوبه می کنیم.
- لام های آماده شده را با چسب انتلان و لامل مونت میکنیم و لام ها را در مکان تاریک نگهداری می کنیم.
- اکنون لام ها را می توان زیر میکروسکوپ نوری بررسی و آنالیز کنیم و از نمونه های رنگ شده به روش گلژی تصاویر با کیفیت تهیه کنیم.
تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی گلژی
مواد مورد نیاز
- اتانول مطلق
- پارافین
- آب مقطر
- فرمالین ۱۰ درصد
- چسب انتلان
- کیت رنگآمیزی گلژی
- محلول نقره نیترات
- پتاسیم بیکرومات ۳%
- محلول آمونیاک
- سدیم تیوسولفات ۵ درصد
تجهیزات مورد نیاز
- میکروسکوپ نوری
- دستگاه میکروتوم
- جار رنگآمیزی لام
- لام و لامل
- تیشوبسکت
جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.
تفسیر نتایج در رنگآمیزی گلژی
رنگآمیزی اختصاصی گلژی همان رنگآمیزی نقره تغییر یافته، به عنوان متدی مهم جهت مطالعه مورفولوژی نورونها می باشد. اساس این تکنیک رسوب فلز در گروهی رندم از نورونها در نمونه های بافتی می باشد. چند پروتکل مختلف از جمله Golgi–Cox ، Rapid ، Golgi–Kopsch برای رنگآمیزی اختصاصی وجود دارد. اگر برشی نازک از مغز تهیه شود و با میکروسکوپ نوری پس از رنگآمیزی های دیگر بجز رنگآمیزی گلژی بررسی گردد سلولهایی قابل مشاهده هستند که حداکثر تا ۴ میکرون اطراف سلولها مشخص است و بقیه آن قابل مشاهده نمی باشد و چنانچه قطر برش افزایش داده شود تعداد زیادی از آکسون های نورونها در هم تنیده شده و قابل بررسی نیستند چرا که اگر رشته ای از آکسون را ادامه داده نمیتوانیم متوجه شویم که به سلول می رسد یا نه. رنگآمیزی نورونها با رسوب نقره که همان رنگآمیزی گلژی است در حل این مشکل به محققان حوزه نوروساینس کمک کرده است.
روش رنگآمیزی گلژی-کاکس (COX-Golgi) یکی از بهترین تکنیک ها برای مطالعه مورفولوژی طبیعی و غیر طبیعی نورون ها و همچنین سلولهای گلیال می باشد. با استفاده از تکنیک گلژی، تغییرات مورفولوژیکی در دندریت سلولهای عصبی و خارهای دندریتیک در مغز حیوانات تحت درمان با دارو و همچنین در مغز پس از مرگ بیماران مبتلا به بیماری های عصبی مورد بررسی قرار می گیرد. با استفاده از پروتکل رنگآمیزی گلژی، آکسونها و دندریت های سلولهای عصبی با رسوب فلز نقره روی آنها به رنگ مشکی زیر میکروسکوپ نوری قابل مشاهده و مطالعه می باشد.
ارائه خدمات رنگآمیزی اختصاصی گلژی در آزمایشگاه بافت شناسی
سلولهای هر بافتی از بدن موجود زنده یک یا چند رنگآمیزی اختصاصی خود را دارد که مطالعه و بررسی بافت را در مسیر تحقیقات در زمینه بیماریهای مختلف تسهیل می کند. لازم به ذکر است یکی از خدمات ارائه شده مرتبط با طرح های پژوهشی محققین در بخش پاتولوژی شرکت بافت و ژن پاسارگاد، رنگ آمیزی های تخصصی انواع بافت های انسانی و حیوانات آزمایشگاهی از جمله رنگآمیزی اختصاصی سیستم عصبی مرکزی می باشد که با تجهیزات آزمایشگاهی استاندارد و باکیفیت ترین مواد توسط کارشناسان باتجربه انجام می شود.
جمع بندی
آنالیز ساختار عصبی و ارتباطات نورونی یک ابزار قوی در نوروساینس تشخیصی و پایه ای است. تغییرات در مورفولوژی نورونی مرکز تکوین و شکل پذیری مغز است و همچنین نشاندهنده بیماری های سیستم عصبی مرکزی می باشد. بنابراین در حوزه مطالعات پاتولوژی و آسیب‌شناسی، تکنیک های رنگآمیزی اختصاصی با کیفیت بالا در نوروساینس از جمله رنگآمیزی گلژی بسیار حائز اهمیت می باشد. رنگآمیزی گلژی یک تکنیک مرسوم بر پایه رسوب فلزی به نام نقره در سلولهای عصبی است که مدت هاست از آن در تشخیص پزشکی و مطالعات بیماریهای سیستم عصبی مرکزی کاربرد دارد. به عنوان مثال تحقیقات گسترده ای در شناخت بیماری آلزایمر با ترکیب تکنیک رنگآمیزی گلژی با نشاندار کردن فلورسنت (Fluorescent Labeling) در مدلهای بیماری آلزایمر انجام شده است.
سوالات متداول
❔ ماده اصلی در رنگ آمیزی گلژی چیست؟
✔️ محلول نیترات نقره نقش اساسی را در پروتکل رنگ آمیزی گلژی ایفا می‌کند.
❔ کدام گروه از بیماری‌ها در رنگ آمیزی گلژی مطالعه می‌شود؟
✔️ در حوزه نوروساینس، تکنیک گلژی برای مطالعه بیماریهای سیستم عصبی کاربرد دارد.
دانلود PDF
