انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR

به طور کلی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) با اهداف زیر صورت می گیرد

• بررسی کمی تغییرات بیان ژن ها در شرایط نرمال و بیماری یا تیمارهای مختلف
• تهیه نسخه ‌های متعدد از یک ژن جهت کلون کردن آن در پلاسمید و بیان ژن مورد نظر در ارگانیسمی دیگر
• بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA که به منظور تشخیص بیماری های ژنتیکی قبل از تولد، تعیین جنسیت، بررسی عفونت‌های باکتریایی و ویروسی

برای مشاهده ی آموزش ویدئویی واکنش زنجیره ای پلیمراز اینجا کلیک کنید یا به انتهای مطلب مراجعه کنید.

اصول انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR

روش PCR بر مبنای یک برنامه دمایی شامل سه مرحله تکرار شونده در ۳۰ الی ۴۰ سیکل انجام می شود که شامل موارد زیر هستند:

• مرحله دناتوراسیون (Denaturation )

در طی این مرحله DNA دو رشته‌ای به واسطه اعمال حرارتی در حدود ۹۵-۹۰ درجه سانتی‌گراد از هم جدا می‌شوند.

• مرحله اتصال پرایمر (Annealing)

در این مرحله، دما به ۵۳ الی ۶۵ درجه سانتی‌گراد رسیده تا پرایمرها در محل مناسب خود روی رشته الگو متصل شوند.

• مرحله تکثیر(Extension)

در این مرحله که دمای آن مناسب فعالیت آنزیم DNA پلیمراز است، تکثیر DNA هدف صورت می‌گیرد. در دمای حدود ۷۲ درجه سانتی‌گراد آنزیم پلیمراز مقاوم به حرارت با مصرف چهار نوع نوکلئوتید dATP، dGTP، dTTP، dCTP موجود در محیط بافری حاوی پرایمرهای جفت شده به DNA و در حضور MgCl_۲ به عنوان کوفاکتور آنزیم، واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می‌نماید و سبب طویل‌ شدن رشته DNA جدید می‌گردد. پس از حدود ۳۰ الی ۴۰ سیکل، از مقدار بسیار کم DNA، صدها هزار نسخه DNA ساخته می شود.

انواع مختلف PCR

Traditional PCR

در روش Traditional PCR یا End-point PCR، پس از پایان واکنش PCR، محصولات PCR با استفاده از روش الکتروفورز بر روی ژل آگارز قابل شناسایی خواهند بود. این روش کیفی بوده و حضور باند بر روی ژل تنها بیانگر حضور ژن یا قطعه DNA تکثیر شده مورد نظر در طی PCR می باشد.   

از محدودیت های روش traditional PCR می توان به موارد زیر اشاره کرد

• روشی زمان بر محسوب می شود
• دقت پایین: مشاهده نتایج بر مبنای اندازه باند مشاهده شده روی ژل است که ممکن است دقیق نباشد
• حساسیت پایین: ژل آگارز ممکن است قدرت تفکیک باندهایی با اندازه های کوچک و نزدیک به هم را نداشته باشد
• روشی کیفی است
• مراحل پس از PCR جهت مشاهده نتایج حاصل متعدد بوده و شامل اکتروفورز بر روی ژل آگارز، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم برماید و مشاهده ژل با استفاده از دستگاه UV می شوند.

Real-Time PCR یا qPCR

در این روش از ترموسایکلرهای مجهز به سیستم فلورومتری استفاده می شود که امکان پایش پیوسته فلورسانس ساطع شده از محصول PCR را فراهم می کنند. در این روش از رنگ های فلورسانت متصل شونده به DNA دو رشته ای یا پروب‌های نشان‌ دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای ´۵ به ´۳ استفاده می‌شود که امکان پایش پیوسته محصول PCR را بدون نیاز به روش‌های الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی‌آکریل‌آمید را فراهم می آورد. این روش که در سال ۱۹۹۲ ابداع شد به دلیل قابلیت هایی نظیر کاهش زمان سیکل‌های PCR، حذف مرحله Post-PCR و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابشی، به سرعت مورد استقبال و استفاده گسترده قرار گرفت.

کاربردهای Real-Time PCR:

• تعیین تیتر ویروس ها
• بررسی کمی بیان ژن ها
• ارزیابی آسیب های DNA
• شناسایی پاتوژن ها
• کنترل کیفی

فواید استفاده از Real-Time PCR

• مشاهده در لحظه نتایج در حین انجام فرآیند PCR
• حساسیت بالا
• عدم نیاز به فرآیندهای پس از PCR

مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت – سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافت – آموزش جامع طراحی پرایمر
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR

خلاصه ای از آموزش تکنیک های استخراج RNA، سنتز cDNA و Real time PCR

در صورتی که در مشاهده ویدئو مشکل دارید اینجا یا اینجا کلیک کنید