گلچين مطالب علميمطالب علميمطالب علمیمولکولی

سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافت

سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافت

برای مشاهده ی آموزش ویدئویی سنتز cDNA از RNA استخراج شده اینجا کلیک کنید یا به انتهای مطلب مراجعه کنید.

رشته DNA مکمل یا cDNA ، رشته هایی از جنس DNA بوده که در طی واکنشی به نام نسخه برداری معکوس یا reverse transcription از روی رشته های RNA ، به طور خاص mRNA ، ساخته می شوند و چون توالی آن ها مکمل mRNA می باشد به آن Complementry DNA یا cDNA گفته می‌شود.

از cDNA برای کلون کردن ژن در سلول‌ها، ساختن کتابخانه cDNA و یا به‌ عنوان پروب در آنالیز ژن‌ها استفاده می‌شود. یکی از مهم‌ترین کاربردهای cDNA ، بررسی سطح بیان ژن‌ ها به صورت کمی می باشد.

سنتز cDNA از  RNA استخراج شده

بررسی تغییرات بیان ژن ها در یک سلول یا بافت در دو سطح RNA و پروتئین قابل بررسی و اندازه گیری می باشد. در هر زمان یا شرایطی، محتوای RNA و به طور خاص mRNA های یک سلول یا بافت بیانگر ژن هایی است که در آن سلول یا بافت بیان می شوند. بنابراین با اندازه گیری میزان بیان mRNA ها به روش هایی مانند RT-PCR یا Real Time PCR می توان به بررسی تغییرات بیان ژن در هر سلول یا بافتی اقدام نمود. به این منظور لازم است محتوای mRNA سلول یا بافت مورد نظر به وسیله روش های استخراج RNA به دست آید، اما در واکنش PCR، آنزیم DNA پلیمراز به الگویی از جنس DNA نیاز دارد بنابراین  mRNA ها نمی توانند مستقیما به عنوان الگوی واکنش PCR مورد استفاده قرار گیرند. در نتیجه در طی واکنش توسط آنزیم های نسخه بردار معکوس (Reverse transcriptase) از رشته های mRNA ، رشته DNA مکمل (cDNA) ساخته می شود.   

واکنش سنتز cDNA شامل مواد زیر می باشد:

  • بافر RT مخصوص آنزیم نسخه بردار معکوس
  • آنزیم RT که معمولا از آنزیم های نسخه بردار معکوس با منشا ویروسی استفاده می گردد نظیر MMLV، AMV و HIV-1
  • چهار نوع نوکلئوتید ( dNTP ها)
  • پرایمرهای مخصوص سنتز cDNA که معمولا شامل دو نوع پرایمر عمومی Olio dT و random hexamer و یا پرایمر اختصاصی طراحی شده برای mRNA هدف (specific primer) می باشند.

رشته های  cDNA در محدوده دمایی مناسب برای فعالیت آنزیم های RT یعنی ۳۷ الی ۵۰ درجه سانتی گراد ساخته می شوند که پس از آن غیر فعال سازی آنزیم در دمای حدود ۷۵ الی ۹۵ درجه سانتی گراد صورت می گیرد. cDNA های ساخته شده در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد به مدت طولانی قابل نگهداری می باشند.

مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافتروش های از بین بردن DNA ژنومی در RNA استخراج شدهآموزش جامع طراحی پرایمر

خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک Real time PCR

خلاصه ای از آموزش تکنیک های استخراج RNA، سنتز cDNA و Real time PCR

در صورتی که در مشاهده ویدئو مشکل دارید اینجا یا اینجا کلیک کنید

برچسب ها
نمایش بیشتر
دکمه بازگشت به بالا
بستن