سلولي و مولكوليمطالب علميمولکولی

طراحی پرایمر

طراحی پرایمر

برای مشاهده ی آموزش ویدئویی طراحی پرایمر اینجا کلیک کنید یا به انتهای مطلب مراجعه کنید.

پرایمرها یا آغازگرها، توالی های کوتاهی از جنس DNA هستند که معمولاً از ۱۸ تا ۲۴ باز تشکیل شده اند و به عنوان نقطه‌ آغاز تکثیر DNA توسط آنزیم DNA پلیمراز در طی فرآیند PCR عمل می‌کنند. آنزیم های DNA پلیمراز تنها قادر هستند نوکلئوتیدها را به انتهای ´۳ یک رشته DNA در حال ساخت اضافه کنند، پرایمرها از اجزای ضروری فرآیند تکثیر DNA محسوب می شوند. بنابراین طراحی پرایمرهای مناسب برای درست انجام شدن یک واکنش PCR و تکثیر قطعه مورد نظر با کارایی بالا بسیار ضروری است.

برای طراحی پرایمر ابتدا باید توالی ژن مورد مطالعه را با فرمت FASTA از بانک های توالی اسید نوکلئیک بدست آورد که یکی از معروف ترین آن ها سایت NCBI می باشد. در مرحله بعد، جهت طراحی پرایمر از نرم افزارهای مختلفی نظیر Oligo، gene runner، primer3، beacon designer می توان استفاده کرد.

طراحی پرایمر نیازمند رعایت یکسری اصول مهم و اساسی می باشد که در ادامه به برخی از آنان اشاره می شود:

۱-  طول پرایمر:

معمولا، طول ۱۸ الی ۲۲ نوکلئوتید برای یک پرایمر مناسب است. اگر طول پرایمر کمتر باشد، احتمال اتصال غیر اختصاصی پرایمر به رشته DNA الگو افزایش می یابد و چنانچه طول پرایمر بیشتر از این محدوده باشد، اتصال پرایمر به الگو به سخت­ی صورت می گیرد.

طراحی پرایمر

۲-  دمای ذوب پرایمرها:

دمای ذوب پرایمرها یا به اصطلاح  Tm، دمایی است که در آن دو رشته ­ی پرایمر از هم جدا شده و تبدیل به DNA  تک رشته­ ای می شود. این دما تخمینی از میزان پایداری هیبرید DNA-DNA است و در تعیین دمای اتصال خیلی اهمیت دارد. به طور معمول، دمای ذوب بین ۵۵ الی ۶۵ درجه برای پرایمرها مناسب می باشد. از دمای ذوب برای محاسبه دمای اتصال (Ta) پرایمرها استفاده می شود.

آموزش طراحی پرایمر

۳- دمای اتصال پرایمرها:

دمای اتصال (Ta) پرایمر در واکنش PCR، دمایی است که در آن پرایمرها به DNA الگو متصل می شوند. اگر دمای اتصال خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو از هم جدا باقی می­ مانند و اتصالی صورت نمی ­گیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد تنها برخی از نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو متصل می­شود و اتصال درستی رخ نمی ­دهد و محصولات غیر اختصاصی تولید می­ شود. دمای اتصال پرایمرهای رفت و برگشت باید نزدیک به هم باشند.

۴-  محتوای GC

نسبت بازهای GC به کل بازها در توالی پرایمر باید بین ۴۰-۶۰ درصد باشد.

۵- گیره GC CLAMP) GC)

وجود بازهای GC در پنج باز انتهای´۳ پرایمرها (که به آن گیره GC گفته می­شود) به علت اتصال قوی تر پیوند بین بازهای G و C ، اتصال اختصاصی در انتهای ´۳ را بهبود می ­بخشد.

۶-  ساختار ثانویه پرایمر:

تشکیل ساختارهای ثانویه­ درون مولکولی در هر پرایمر یا بین دو پرایمر باعث کاهش کارایی PCR و عدم تولید محصول PCR  کافی می­شود. این ساختارها به میزان قابل توجهی دسترسی به پرایمرها را کاهش می­دهند.

۷- ساختارهای سنجاق سری (hairpins):

این ساختارها جزء برهم کنش­ های درون مولکولی پرایمرها هستند. اگر انتهای ´۳ پرایمر دارای یک ساختار سنجاق سری با ΔG= -2 kcal/mol و یا یک ساختار سنجاق سری درونی با ΔG= -3 kcal/mol داشته باشد، معمولا قابل تحمل است و مشکلی ایجاد نمی­کند. (انرژی آزاد گیبس یا ΔG هرچه منفی تر باشد یعنی ساختار سنجاق سری پایداتر است).

۸- دیمر خودی (self dimer):

دیمر خودی پرایمر ناشی از برهم کنش­ های بین مولکول­ های یک پرایمر است. معمولا در یک واکنش از مقادیر زیادی از پرایمرها نسبت به میزان الگوی PCR استفاده می­شود. وقتی پرایمرها تمایل شان برای اتصال به خودشان بیشتر از تمایل شان برای اتصال به الگو باشد، محصول PCR کمتری تولید می­شود. معمولا دیمر انتهای ´۳ با ΔG= -5 kcal/mol  و دیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.

۹- هترو دیمر (Hetero dimer):

هترودیمر، دیمرهایی هستند که براساس برهم کنش ­های بین مولکولی بین پرایمرهای رفت و برگشت به وجود می­آیند. به طور معمول هترودیمرهای انتهای´۳ با ΔG= -5 kcal/mol و هترودیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol  قابل تحمل هستند.

طراحی پرایمر
طراحی پرایمر

۱۰- تکرارها:

شامل تکرارهای دو نوکلئوتیدی که مدام در یک توالی تکرار می­ شوند، است. حداکثر تعداد تکرارهای قابل قبول، ۴ تکرار دو نوکلئوتیدی است.

۱۱- تکرارهای تک نوکلئوتیدی (Runs):

منظور پرایمرهایی با تکرارهای تک نوکلئوتیدی زیاد، پشت سر هم است که می­تواند باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمر شود. به عنوان مثال AGCGGGGGATGGGG تکرارهای ۵ و ۴ تایی از G را دارد. حداکثر تعداد تکرار قابل قبول برای یک باز، ۴ جفت باز است.

۱۲- پرهیز از هومولوژی:

برای بالا بردن اختصاصیت پرایمرها باید از نواحی هومولوگ دوری کرد. به عبارت ساده­ تر، پرایمرها باید به گونه ­ای طراحی شوند که نواحی دیگر ژنومی را شناسایی نکرده و به آن ها متصل نشوند. با انجام BLAST می توان از اختصاصی بودن پرایمرها اطمینان پیدا کرد.

مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت – سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافتواکنش زنجیره ای پلیمراز PCR

خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR

آموزش کامل طراحی پرایمر

در صورتی که در مشاهده ویدئو مشکل دارید اینجا یا اینجا کلیک کنید

برچسب ها
نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

یک نظر

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

4 × سه =

دکمه بازگشت به بالا
بستن