مولکولی

اصول طراحی پرایمر

آموزش طراحی پرایمر

برای مشاهده ی آموزش ویدئویی طراحی پرایمر اینجا کلیک کنید یا به انتهای مطلب مراجعه کنید.

مولکول های پرایمر، اولیگوداکسی ریبونوکلئوتید یا اولیگومر و یا به عبارت دیگر DNA تک رشته ای (ssDNA) هستند که از اجزای ضروری برای PCR می باشند، این مولکول ها  بصورت شیمیایی برای منطقه مشخص از DNA هدف ساخته می‌شوند. در فرآیند PCR، همانندسازی و تکثیر DNA توسط آنزیم DNA پلیمراز ، نیازمند هیدروکسیل آزاد در انتهای ‘۳ رشته در حال سنتر می باشد. در شرایط خارج از سلول، انتهای آزاد با کمک پرایمر ایجاد می‌شود. پرایمر، توالی است که  به صورت مکمل برای قسمت خاصی از توالی DNA الگو ساخته شده و قادر است بطور اختصاصی به جایگاه هدف هیبرید شده و انتهای ‘۳ یا هیدروکسیل آزاد ایجاد کند. این انتهای آزاد، به عنوان سوبسترا در اختیار DNA  پلیمراز قرار گرفته و سنتز توالی مکمل را فراهم می‌کند.

از میان بسیاری از فاکتورهایی که بر روی اختصاصیت واکنش PCR موثر است، هیچ کدام به اندازه‌ی انتخاب پرایمر دارای اهمیت نمی باشند، انتخاب با دقت پرایمرها، برای بدست آوردن محصولات مناسب با خلوص بالا  بسیار حائز اهمیت است. هیبرید شدن پرایمرها با DNA ژنومیک پدیده ای وابسته به دما است. به طوریکه اگر دمای اتصال خیلی بالا باشد، اتصال پرایمر با DNA الگو صورت نمی‌گیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد، اتصال به صورت خیلی اختصاصی انجام نگرفته و پرایمرها در نقاط متعدد که شباهت مختصری با توالی مورد نظر دارند به DNA الگو متصل می گردند و در نهایت باندهای متعدد و غیر اختصاصی مشاهده خواهد شد.

بنابراین درجه حرارت ایده آل برای اتصال پرایمرها باید به اندازه کافی پایین باشد تا اتصال پرایمرها به DNA الگو را امکان پذیر سازد و از طرف دیگر باید به اندازه کافی بالا باشد که مانع از ایجاد اتصالات غیراختصاصی شود. بنابراین بهترین دمای اتصال، بالاترین دمایی است که در آن محصول PCR، به اندازه کافی تولید شود. از طرفی توالی پرایمر مطلوب و غلظت پرایمر مناسب برای دستیابی به حداکثر ویژگی و کارایی PCR ضروری می باشد. پرایمر ضعیف طراحی شده می تواند منجر به تولید و یا عدم تولید محصول شده و یا به علت تکثیر غیر اختصاصی و تشکیل پرایمر دایمر، نتایج نامناسبی را ارائه دهد. جهت انتخاب صحیح توالی پرایمر ابزارهای بیوانفورماتیکی مختلف برای انتخاب جفت پرایمرها از یک توالی الگو در دسترس می باشند.

نکات طراحی پرایمر

الگوی DNA و پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی باید طوری طراحی شوند که اثر بخشی  و حساسیت پرایمر را تا حد امکان بالا ببرد. توانایی الیگونوکلئوتیدها به عنوان پرایمر برای PCR به چندین عامل وابسته می باشد که از جمله می توان به موارد زیر اشاره کرد:

طول پرایمر

از آنجایی که هر دو ویژگی دما و زمان اتصال حداقل تا حدی به طول پرایمر وابسته است، به همین دلیل به عنوان یکی از فاکتورهای کلیدی در فرآیند PCR تلقی می‌شود. براساس مطالعات متعدد، بهترین طول پرایمر به طور معمول ۳۰-۱۸ نوکلئوتید می باشد پرایمرها حداقل باید ۱۸ نوکلئوتید طول داشته باشند تا احتمال مشکلات پیش رو با جایگاه هیبریداسیون ثانویه روی وکتور یا جایگاه ورود آن را به حداقل برساند.

طراحی پرایمر

دمای ذوب (Tm)پرایمرها

دمایی که برای مراحل اتصال پرایمر استفاده می‌شود Anniealing temprature بسیار مهم است. اگر دما خیلی بالا باشد همه پرایمرها به هدف متصل نمی‌شوند و در نهایت محصول کمی به دست می‌آید و اگر دما پایین باشد اتصال پرایمرها به DNA غیر اختصاصی خواهد بود. دمای اتصال پرایمر معمولا ۲ تا ۵ درجه پایینتر از دمای Tm پرایمرها است که دراین دما نصف پرایمرها به DNA الگو اتصال دارند.

آموزش طراحی پرایمر

دمای اتصال پرایمرها

دمای اتصال (Ta) پرایمر در واکنش PCR، دمایی است که در آن پرایمرها به DNA الگو متصل می شوند. اگر دمای اتصال خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو از هم جدا باقی می­ مانند و اتصالی صورت نمی ­گیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد تنها برخی از نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو متصل می­شود و اتصال درستی رخ نمی ­دهد و محصولات غیر اختصاصی تولید می­ شود. دمای اتصال پرایمرهای رفت و برگشت باید نزدیک به هم باشند.

توالی انتهای ‘۳

 یکی از نکات مهم در طراحی انتهای ‘۳ پرایمر مرتبط با تعداد نوکلئوتیدها G یا C می باشد، وجود بیش از دو نوکلئوتید G و C در انتهای ‘۳ باعث اتصال مستحکم پرایمر به نواحی غیر اختصاصی غنی از G/Cدر DNA هدف می گردد. همچنین عنوان می شود که قرار گیری ریشه آدنوزین یا تیمیدین ماقبل آخر (یک نوکلئوتید مانده به انتهای ‘۳) کیفیت پرایمر را بهبود می‌بخشد. از نقطه نظر تئوری انتهای ‘۳ غنی باز T/A احتمال تشکیل دایمر پرایمر را کاهش می دهد.

طراحی پرایمر بر اساس نواحی پایدار DNA هدف

انتخاب توالی مناسب جهت طراحی پرایمر از نواحی پایدار DNA هدف (نواحی که در آنها احتمال وقوع جهش‌ها کمتر است) توصیه می شود، مناطقی از DNA هدف که احتمال جهش در آنها بالاست، جهت طراحی پرایمر، خصوصا برای مقاصد تشخیصی مطلوب نیست، بنابراین بهتر است از نواحی حفاظت شده استفاده شود، انتخاب توالی مناسب برای طراحی را می‌توان از طریق http://www.ncbi.nlm.nih.gov GenBank جستجو کرد.

محتوای GC

محتوای GC پرایمر ها اثر قابل توجهی بر پایداری هیبرید پرایمر و DNA دارد. به طور کلی محتوای GC به میزان ۵۰% از توالی طراحی شده بهترین حالت ممکن می‌باشد. با افزایش محتوای GC درجه حرارت اتصال پرایمر بالاتر خواهد رفت و به دنبال آن باعث افزایش اختصاصیت و استحکام اتصال پرایمر و توالی الگو می‌شود. اگر در مواردی لازم است دمای اتصال پرایمر را افزایش دهیم پیشنهاد می شود به جای افزایش محتوای GC، طول توالی مورد نظر را افزایش دهیم، با این کار احتمال افزایش نواحی سنجاق سری را در پرایمر کاهش می‌دهیم.

ساختارهای سنجاق سری (hairpins)

این ساختارها جزء برهم کنش­ های درون مولکولی پرایمرها هستند. اگر انتهای ´۳ پرایمر دارای یک ساختار سنجاق سری با ΔG= -2 kcal/mol و یا یک ساختار سنجاق سری درونی با ΔG= -3 kcal/mol داشته باشد، معمولا قابل تحمل است و مشکلی ایجاد نمی­کند. (انرژی آزاد گیبس یا ΔG هرچه منفی تر باشد یعنی ساختار سنجاق سری پایداتر است).

ساختار ثانویه پرایمر

تشکیل ساختارهای ثانویه­ درون مولکولی در هر پرایمر یا بین دو پرایمر باعث کاهش کارایی PCR و عدم تولید محصول PCR کافی می شود. این ساختارها به میزان قابل توجهی دسترسی به پرایمرها را کاهش می ­دهد.

دیمر خودی (self dimer)

دیمر خودی پرایمر ناشی از برهم کنش­ های بین مولکول­ های یک پرایمر است. معمولا در یک واکنش از مقادیر زیادی از پرایمرها نسبت به میزان الگوی PCR استفاده می­شود. وقتی پرایمرها تمایل شان برای اتصال به خودشان بیشتر از تمایل شان برای اتصال به الگو باشد، محصول PCR کمتری تولید می­شود. معمولا دیمر انتهای ´۳ با ΔG= -5 kcal/mol  و دیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.

طراحی پرایمر

هترو دیمر (Hetero dimer)

هترودیمر، دیمرهایی هستند که براساس برهم کنش ­های بین مولکولی بین پرایمرهای رفت و برگشت به وجود می­آیند. به طور معمول هترودیمرهای انتهای´۳ با ΔG= -5 kcal/mol و هترودیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol  قابل تحمل هستند.

طراحی پرایمر

تکرارهای نوکلئوتیدی ها

شامل تکرارهای دو نوکلئوتیدی که مدام در یک توالی تکرار می­ شوند، است. حداکثر تعداد تکرارهای قابل قبول، ۴ تکرار دو نوکلئوتیدی است.

تکرارهای تک نوکلئوتیدی (Runs)

منظور پرایمرهایی با تکرارهای تک نوکلئوتیدی زیاد، پشت سر هم است که می­تواند باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمر شود. به عنوان مثال AGCGGGGGATGGGG تکرارهای ۵ و ۴ تایی از G را دارد. حداکثر تعداد تکرار قابل قبول برای یک باز، ۴ جفت باز است.

پرهیز از هومولوژی

برای بالا بردن اختصاصیت پرایمرها باید از نواحی هومولوگ دوری کرد. به عبارت ساده­ تر، پرایمرها باید به گونه ­ای طراحی شوند که نواحی دیگر ژنومی را شناسایی نکرده و به آن ها متصل نشوند. با انجام BLAST می توان از اختصاصی بودن پرایمرها اطمینان پیدا کرد.

مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت – سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافتواکنش زنجیره ای پلیمراز PCR

خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR

آموزش کامل طراحی پرایمر

در صورتی که در مشاهده ویدئو مشکل دارید اینجا یا اینجا کلیک کنید

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

1 دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پنج + 17 =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا