پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی ساده ترین شکل پلی مورفیسم بین دو ژنوم تصادفی است. SNP(single nucleotide polymorphism) به جایگزینی یک نوکلئوتید به جای نوکلئوتید دیگر در یک مکان خاص بروی ژنوم گفته می شود که در بیش از ۱٪ از جمعیت یافت می شود.
از زمان تکمیل پروژه ژنوم انسانی در سال ۲۰۰۳ و پروژه بین‌المللی HapMap در سال ۲۰۰۵ تا مطالعات اخیر، پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNPs) به دلیل فراوانی در ژنوم و تحلیل نسبتا آسان، یکی از مهم‌ترین نشانگرهای ژنتیکی محسوب می‌شوند.
SNP ها تقریباً هر ۸۰۰ جفت باز (bp) در سراسر ژنوم رخ داده در طول کل ژنوم بیش از ۹ میلیونSNP وجود دارد.
اساس ARMS-PCR بر استفاده از پرایمر های PCR مختص توالی است که تنها زمانی که آلل هدف در نمونه وجود داشته باشد، امکان تکثیر توالی DNA را فراهم می کند. به دنبال واکنش ARMS، وجود یا عدم وجود محصول PCR برای وجود یا عدم وجود آلل هدف تشخیص داده می شود.
مطالب مرتبط: تکنیک ARMS-PCR – اصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
از سه پرایمر در ARMS-PCR استفاده می‌شود و فقط با استفاده از ژل الکتروفورز، وجود یا عدم وجود محصول PCR تائید می شود.
به منظور بازده مناسب این تست، لازم است طراحی پرایمر اصولی و کارآمد انجام پذیرد. در این مطلب به طراحی پرایمر ARMS با استفاده از نرم افزار Gene Runner می پردازیم همراه ما باشید.
مراحل طراحی پرایمر ARMS-PCR
- در ابتدا ناحیه مورد نظر پلی مورفیسم خود را از سایت NCBI قسمتSNP با کلیک روی Varview جستجو کنید. (به عنوان مثال ژن COMT برای rs4680).
- وارد سایت Ensembl شوید و اطلاعات ژن مورد نظر و گونه مورد مطالعه را در باکس های مربوط وارد کنید.
- زمانیکه وارد ژن مورد نظر شوید و تمامی رونوشت های مربوط به ژن نمایش داده می شود. که باید ناحیه مربوط به پلی مورفیسم را در واریانت موجود پیدا کرده و وارد رونوشت شوید و سمت چپ صفحه Exons را انتخاب کنید.
مطالب مرتبط: آموزش طراحی پرایمر qPCR – مبانی طراحی پرایمر miRNA
- پلی مورفیسم مورد نظر را در توالی مربوط به ناحیه موجود پیدا کنید.
- قسمتی از توالی های بالا دست و پایین دست پلی مورفیسم را انتخاب کرده و در فایل word منتقل کنید. سپس توالی ها را بدون فاصله و با دقت در هر ردیف مرتب سازید. در نهایت پلی مورفیسم خود را در فایل word مشخص سازید.
- در مرحله بعد کل توالی مرتب شده را به نرم افزار Gene Runner منتقل کنید و مجددا ناحیه دارای پلی مورفیسم را تعیین کنید.
- در طراحی ARMS-PCR باید به این نکته توجه داشته باشید که پلیمورفیسم حتما باید در انتهای ´۳ یکی از پرایمر های Forward یا Reverse قرار گیرد. و طراحی این بخش از پرایمر مقداری چالش برانگیز و حساس می باشد. زیرا محدودیت در انتخاب پرایمر خواهیم داشت و از طرفی باید این نکته را در نظر داشته باشیم که پرایمر از نظر دایمر و ساختار سنجاق سری و حضور پلی مورفیسم های دیگر در آن منطقه بدون مشکل خواهد بود. اگر بخواهیم در این نقطه توالی را دستکاری کنیم باید توجه داشته باشیم که این امر فقط از سمت ´۵ پرایمر امکان پذیر می باشد و اجازه هیچ گونه تغییری در سمت ´۳ پرایمر نخواهیم داشت.
- پس از انتخاب توالی مورد نظر به عنوان پرایمر ، جهت بررسی کیفیت پرایمر ، روی ناحیه انتخابی کلیک راست کرده و گزینه Oligo Analysis را انتخاب کنید.
مطالب مرتبط: اصول طراحی پرایمر – استخراج DNA از سلول و بافت
- با باز شدن صفحه مورد نظر شما می توانید جزئیات ناحیه انتخابی خود را از نظر دمای Tm، سایز قطعه، درصد GC، وجود دایمر و توالی سنجاق سری و …. آنالیز و تصمیم گیری کنید که آیا توالی انتخاب شده به عنوان پرایمر مناسب هست یا خیر. در صورت مناسب بودن برای همین ناحیه باید پرایمر موتانت برای واریانت جهش یافته نیز در نظر گرفته شود. به گونه ای که تمام توالی همین پرایمر است و تنها نوکلئوتید اخر که نوکلئوتید مربوط به پلی مورفیسم می باشد را تغییر داده و نوکلئوتید موتانت را جایگزین نوکلئوتید نرمال خواهیم کرد. تا در صورت حضور جهش پرایمر به ناحیه مورد نظر متصل شود.
- سپس برای پرایمر اول طراحی شده، پرایمر مکمل را مطابق با الگوی اولیه طراحی خواهیم کرد. با این تفاوت که حداقل ۱۰۰ نوکلئوتید با پرایمر اصلی فاصله داشته باشد و از روی رشته مقابل طراحی صورت گیرد. و در صورت نیاز می توانتغییرات پرایمر مکمل را در هر دو سمت ´۳ و ´۵ اعمال کرد.
- پرایمر های انتخاب شده را در سایت NCBI قسمت Primer Blast، مورد سنجش و ارزیابی قرار خواهیم داد.
مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت – سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافت
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR
