واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) اولین بار در سال ۱۹۸۳ توسط Kary Muliss ابداع شد، در واقع همان روش همانندسازی DNA در سلول است که در شرایط آزمایشگاهی و خارج از بدن موجود زنده شبیه سازی شده است. با این تفاوت که در همانندسازی، کل محتوای DNA درون سلول (ژنوم) تکثیر می گردد اما در PCR فقط یک ناحیه مشخص شده تکثیر یافته و به میزان زیادی از آن ساخته می شود.
اجزای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
- مولکول های DNA (DNA ژنومی یا DNA مکمل (cDNA) ساخته شده از روی RNA) که به عنوان الگویی برای ساخت نسخه های جدید DNA استفاده می شوند
- آنزیم DNA پلیمراز وابسته به DNA: آنزیم هایی مانند Taq پلیمراز ، PFU یا دیگر آنزیم های پلیمراز مقاوم به حرارت که معمولا از باکتری ها جداسازی شده و به طور گسترده در PCR استفاده می شوند. این آنزیم ها با الگوی قرار دادن رشته DNA موجود، رشته DNA جدید را با استفاده از نوکئوتیدهای موجود در محیط می سازند. بسته به نوع PCR ، هدف و حساسیت تست موردنظر از آنزیم های مختلفی با مقاومت، سرعت و دقت پلیمریزاسیون و قابلیت تصحیح خطاهای احتمالی استفاده می گردد.
- داکسی ریبونوکلئوتیدها (dNTPs) که به عنوان واحدهای مولکولی سازنده رشته های DNA توسط آنزیم پلیمراز مورد استفاده قرار می گیرند و شامل چهار نوع dATP، dGTP، dCTP و dTTP می باشند.
- MgCl2 که معمولا به میزان استاندارد در بافر اختصاصی آنزیم پلیمراز مورد استفاده وجود دارد. یون های منیزیوم (Mg2+) به عنوان کوفاکتور یا یک عامل کمکی جهت فعالیت بسیاری از آنزیم ها از جمله DNA پلیمرازها ضروری می باشد. آنزیم های DNA پلیمراز، DNA الگو تک رشته‌ای شده را از جهت ´۳ به ´۵ شناسایی کرده و رشته مکمل آن را در جهت ´۵ به ´۳ می‌سازند. این آنزیم ها برای آغاز فعالیت پلیمرازی خود به یک انتهای ´۳ نیاز دارند.
- پرایمرها یا آغازگرها که اولیگونوکلئوتیدهایی از جنس DNA هستند که برای تکثیر کل یک ژن، بخشی از آن یا ناحیه خاصی از ژنوم استفاده می شوند. با توجه به هدف آزمایش، پرایمرها با استفاده از نرم افزارهای طراحی پرایمر موجود به صورت مکمل با نواحی خاصی از DNA که در برگیرنده ناحیه مورد نظر جهت تکثیر می شود، طراحی می شوند. با اتصال پرایمرها به ناحیه مکمل خود بر روی DNA الگو، انتهای ´۳ مورد نیاز برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می کنند.
مراحل واکنش زنجیره ای پلیمراز
روش PCR بر مبنای یک برنامه دمایی شامل سه مرحله اصلی در یک دستگاه Thermal-cycler انجام می‌شود. این مراحل عبارتند از:
- مرحله دناتوراسیون (Denaturation )
طی این مرحله DNA دو رشته‌ای به واسطه اعمال حرارتی در حدود ۹۵-۹۰ درجه سانتی‌گراد از هم جدا می‌شوند.
- مرحله اتصال پرایمر (Annealing)
در این مرحله، دما به ۵۳ الی ۶۵ درجه سانتی‌گراد رسیده تا پرایمرها در محل مناسب بر روی رشته الگو متصل شوند.
- مرحله تکثیر(Extension)
در این مرحله که دمای آن مناسب فعالیت آنزیم DNA پلیمراز است، تکثیر DNA هدف صورت می‌گیرد. در دمای حدود ۷۲ درجه سانتی‌گراد آنزیم مقاوم به حرارت با مصرف چهار نوع نوکلئوتید dATP، dGTP، dTTP، dCTP موجود در محیط بافری حاوی پرایمرهای جفت شده به DNA و در حضورMgCl2 ، واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می‌نماید و سبب طویل‌شدن رشته DNA جدید می‌گردد.
پس از حدود ۳۰ الی ۴۰ سیکل، از مقدار بسیار کم DNA، صدها هزار نسخه DNA ساخته می شود که قابل شناسایی خواهند بود.
نتایج حاصل از واکنش PCR بسته به نوع روش PCR مورد استفاده به صورت کیفی (به روش الکتروفورز بر روی ژل آگارز) و یا کمی (در real-time PCR) قابل مشاهده و بررسی می باشد.
منابع
۱.Kuslich, C.D., B. Chui, and C.T. Yamashiro, Overview of PCR. Current Protocols Essential Laboratory Techniques, 2019. ۱۸(۱): p. e27.
۲.Caetano-Anollés, D., Polymerase Chain Reaction, in Brenner’s Encyclopedia of Genetics (Second Edition), S. Maloy and K. Hughes, Editors. 2013, Academic Press: San Diego. p. 392-395
مطالب مرتبط: روش های مختلف استخراج RNA از سلول و بافت – سنتز cDNA از RNA استخراج شده از سلول و بافت – آموزش جامع طراحی پرایمر
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR
