آموزش جامع رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین (Reticulin) در آزمایشگاه بافت شناسی

مقدمه‌ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین در بافت‌شناسی

رنگ رتیکولین فیبرهای رتیکولین که با رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) قابل مشاهده نیستند را رنگ می‌کند. الیاف رتیکولین آژیروفیلیک (agyrophilic) هستند، به این معنی که این الیاف در نمونه های بافتی با استفاده از یک کاهنده شیمیایی، با محلول نقره سیاه رنگ می‌شوند که فیبرها را به شکل قابل مشاهده در می‌آورد. انواع مختلفی از رنگ‌آمیزی رتیکولین مانند Gordon & Sweets, Wilder, Gridley, Snook, Laidlaw, and Gomori قابل ارائه می باشد که با این حال، همه روش‌ها مراحل رنگ‌آمیزی یکسانی دارند که الیاف رتیکولین رنگ می‌کند.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین در بافت‌شناسی

فیبروز یا تشکیل بیش از حد بافت فیبروزی معمولاً در نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان که دارای اختلالات میلوپرولیفراتیو (Myeloproliferative) مانند پلی‌سیتمی ورا (Polycythemia Vera)، میلوفیبروز اولیه یا ایدیوپاتیک (primary or idiopathic myelofibrosis)، ترومبوسیتوز ضروری (essential thrombocytosis)، لوسمی میلوئید مزمن (chronic myeloid leukemia) با رنگ آمیزی اختصاصی رتیکولین نشان داده می‌شود. علاوه بر این، فیبروز را می‌توان در نمونه‌های مغز استخوان که متاستاز تومور قابل توجهی دارند، مشاهده کرد. از آنجایی که چندین وضعیت پاتولوژی نئوپلاستیک و غیرنئوپلاستیک می‌تواند با افزایش فیبروز رتیکولین همراه باشد، پاتولوژیست باید مطمئن باشد که هم کمیت و هم ضخامت الیاف را ارزیابی می کند.

نگاهی اجمالی به فیبرهای رتیکولین رنگ شده با رتیکولین

اجزای فیبری ماتریکس خارج سلولی از نظر آنالیز میکروسکوپ نوری به سه نوع فیبر طبقه‌بندی می‌شوند: کلاژن، رتیکولار و الاستیک. رشته‌های رتیکولین نوعی فیبر در بافت همبند است که از کلاژن نوع III که توسط سلول‌های شبکه‌ای یا رتیکولار ترشح می‌شود، تشکیل شده است. از نظر میکروسکوپ الکترونی، الیاف رتیکولین به صورت منفرد یا دسته کوچکی از فیبریل‌ها مشاهده می‌شوند، اگرچه قطر فیبریل‌ها نازک (حدود ۳۰ نانومتر) و یکنواخت است. فیبرهای رتیکولار از طریق فیبریل‌ها با فیبرهای کلاژن متصل هستند. الیاف رتیکولین به صورت متقاطع به هم متصل می شوند تا شبکه ای ظریف (رتیکولین) را تشکیل دهند. این شبکه به عنوان یک شبکه پشتیبان در بافت‌های نرم مانند کبد، مغز استخوان و بافت ها و اندام‌های سیستم لنفاوی عمل می کند. آنها معمولاً زیر اپیتلیوم قرار می‌گیرند و سطح سلول‌های عضلانی، سلول‌های چربی و سلول‌های شوان (Schwann) را می پوشانند. اختلال در روند سنتز و یا مقدار رتیکولین در بافت ها می تواند عامل ایجاد بیماری مانند فیبروز و سیروز کبدی گردد، بنابراین یکی از روش های تشخیص این بیماری‌ها مطالعه فیبرهای رتیکولین است.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین

رنگ‌آمیزی رتیکولین، یک تکنیک مهم در مطالعه ضایعات مؤثر بر بافت هایی مانند کبد، طحال،گره‌های لنفاوی و مغز استخوان است که ساختمان آن‌ها غنی از رتیکولین است. ای نمونه های بافتی می تواند بصورت تازه، فریز یا فیکس شده در فرمالین جهت انجام تکنیک رنگ رتیکولین استفاده گردد.

در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین می‌پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین در بافت‌شناسی

جهت انجام پروتکل رنگ‌آمیزی رتیکولین، ابتدا می‌بایست محلول نقره نیترات تهیه کنیم. ۵ سی سی از محلول نیترات نقره را در ظرف شیشه ای تیره ریخته و در حالی که روی استیرر میکس می‌شود، آمونیوم هیدروکسید را قطره قطره به محلول اضافه کرده تا رسوبات کاملا حل شود. پس از آن ۵ سی سی از محلول سدیم هیدروکساید ۳% را با احتیاط اضافه کرده و رسوب را مجدداً با هیدروکسید آمونیوم حل می‌کنیم تا زمانی که فقط یک کدری ضعیف مشاهده شود. سپس محلول حاصل را با آب مقطر تا ۵۰ میلی لیتر رقیق کنید و در یک شیشه تمیز فیلتر کنید.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی رتیکولین

1. پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت‌ها را در فرمالین ده درصد یا به‌صورت فریز شده فیکس می‌کنیم.
   
2. در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت‌ها قرارداده و نام یا کد نمونه‌ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
   
3. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین از غلظت‌های افزایشی اتانول استفاده می‌شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
   
4. قالب‌گیری بافت: بلوک‌های پارافینی از نمونه‌های بافتی با پارافین جامد و طبق دستورالعمل‌های دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ تهیه می کنیم.
   
5. برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۴ الی ۵ میکرومتر آماده می کنیم.
   
6. آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
   
7. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ‌آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی رتیکولین

1. ابتدا اسلایدهای آماده شده را در محلول پتاسیم پرمنگنات به مدت ۵ دقیقه قرار می‌دهیم و سپس به مدت دو دقیقه با آب مقطر شستشو می دهیم.
   
2. اسلایدها را در محلول اگزالیک اسید قرار داده تا برش های بافتی بی رنگ شود و با آب مقطر شستشوی مختصر می‌دهیم.
   
3. لام ها را به مدت حداقل ده دقیقه در محلول سولفات آمونیوم فریک انکوبه می‌کنیم و پس از آن سه بار با آب جار شسته و با آب مقطر آبکشی می‌کنیم.
   
4. اکنون روی هر اسلاید ۷ قطره محلول نیترات نقره اضافه کرده و محلول اضافی را با تکان دادن اسلایدها دور می‌ریزیم و نهایتا دو مرتبه سریع با آب مقطر شستشوی مختصر می‌دهیم.
   
5. لام ها را محلول فرمالین ده درصد به مدت ۳۰ تا ۱۲۰ ثانیه انکوبه کرده تا رنگ سیاه یا خاکستری مشاهده گردد و با آب مقطر آبکشی می‌کنیم.
   
6. لام‌ها را در ۰.۲٪ کلرید طلا به مدت حداقل ۱ دقیقه قرار داده تا رنگ پس زمینه زرد حذف گردد و با آب مقطر شستشو می‌دهیم.
   
7. نمونه ها را در محلول ۵% تیوسولفات سدیم به مدت یک دقیقه قرار داده تا نقره‌های احیا نشده حذف گردد.
   
8. پس از شستشوی با آب مقطر، جهت رنگ شدن هسته سلول‌ها، برشهای بافتی را با محلول رنگ Nuclear Fast Red به مدت ۵ دقیقه انکوبه می‌کنیم و پس از شستشو با آب جاری، اجازه می‌دهیم برش های رنگ شده خشک شود.
   
9. لام ها را با لامل و چسب انتلان مونت نموده و نهایتا پس از اتمام مراحل رنگ‌آمیزی رتیکولین، لام‌های آماده شده را با میکروسکوپ نوری بررسی می‌کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی رتیکولین

مواد مورد نیاز

• محلول نیترات نقره
• آمونیوم هیدروکساید
• محلول سدیم هیدروکساید ۳%
• پتاسیم پرمنگنات
• اگزالیک اسید
• سولفات آمونیوم فریک
• کلرید طلا
• محلول ۵% تیوسولفات سدیم
• رنگ Nuclear Fast Red
• آب مقطر
• فرمالین ده درصد
• پارافین جامد
• اتانول مطلق
• چسب انتلان

تجهیزات مورد نیاز

• استیرر
• دستگاه تیشو امبدینگ
• دستگاه پارافین دیسپنسر
• دستگاه میکروتوم
• دستگاه گرمکن اسلاید
• میکروسکوپ نوری
• جار رنگ ­آمیزی لام
• لام و لامل
• تیشو بسکت

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی رتیکولین

فیبرهای رتیکولین میل طبیعی کمی برای محلول‌های نقره دارند، بنابراین باید با پرمنگنات پتاسیم تیمار شوند تا نقاط حساس روی الیاف رتیکولین جهت رسوب نقره ایجاد شود. نقره به شکلی است که به راحتی می تواند به صورت نقره فلزی رسوب کند. یک عامل کاهشی (Reduction) ، فرمالین، باعث رسوب نقره به شکل فلز می‌شود و نهایتا یک رنگ سیاه خنثی با شدت بالا ایجاد می‌کند. الیاف رتیکولوم در کبد، طحال و کلیه به وفور یافت می شود. در یک کبد نرمال، رتیکولین رشته‌های مشخص و منظمی هستند،اما کبد نکروزه و سیروز دارای الگوهای ناپیوسته هستند. رتیکولین همچنین الگوهای مشخصی را در ارتباط با سلول‌های تومور خاص تشکیل می دهد.

فیبروز مغز استخوان در انواع بیماری های بدخیم و غیر بدخیم دیده می شود، رسوب رتیکولین و فیبروز کلاژن در مغز استخوان بیماران مبتلا به میلوفیبروزیس به واسطه سلول بنیادی/پیش ساز خونساز میلوفیبروز ایجاد می‌شود و به اختلال کمک می کند.
نتیجه پروتکل رنگ آمیزی رتیکولین در زیر میکروسکوپ نوری بدین صورت است: در بک گراند صورتی رشته‌های رتیکولین به رنگ سیاه و هسته سلول‌های نمونه به رنگ قرمز مشاهده می‌گردد.

ارائه خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین در آزمایشگاه بافت شناسی

بافت شناسی مطالعه میکروسکوپی بافت های حیوانی و گیاهی از طریق تکنیک رنگ آمیزی و بررسی آنها در زیر میکروسکوپ (الکترونی یا نوری) است. روش‌های مختلفی برای مطالعه ویژگی‌های بافتی و ساختار میکروسکوپی سلول‌ها استفاده می‌شود. مطالعات بافت‌شناسی در علوم تشریح پزشکی قانونی، تحقیقات، تشخیص پزشکی و در آموزش کاربرد دارد. علاوه بر این، بافت‌شناسی به طور گسترده در پزشکی به ویژه در مطالعه بافت‌های بیمار برای کمک به درمان استفاده می‌شود. در هیستوپاتولوژی جهت آنالیز و تشخیص ساختار بافت‌های انسان و حیوانات آزمایشگاهی، نمونه‌ها باید با روش ستاپ شده، رنگ‌آمیزی شوند.

یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه‌های بافتی، رنگ‌آمیزی اختصاصی فیبرهای رتیکولین در بافت‌های موجود زنده به نام رتیکولین است. در آزمایشگاه بافت‌شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، برش‌های میکرونی از نمونه‌های بافتی مختلف، تهیه و با تکنیک‌های رنگ‌آمیزی عمومی و اختصاصی از جمله خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین رنگ نموده و نهایتا به بررسی و مطالعه نمونه بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح‌های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.

جمع‌بندی

تاریخچه بافت شناسی نشان می دهد که تغییرات قابل توجهی در تکنیک های مورد استفاده برای رنگ آمیزی بافت شناسی از طریق سنجش های شیمیایی، زیست شناسی مولکولی و تکنیک‌های ایمونولوژیک، که در مجموع به عنوان هیستوشیمی نامیده می شود، وجود داشته است. بافت‌شناسان اولیه از مواد شیمیایی در دسترس برای آماده سازی بافت ها جهت مطالعات میکروسکوپی استفاده می کردند. این مواد شیمیایی آزمایشگاهی دی کرومات پتاسیم، الکل و کلرید جیوه برای سخت شدن بافت های سلولی بودند. تکنیک‌های رنگ‌آمیزی مورد استفاده شامل نیترات نقره، گیمسا، رنگ آمیزی های تریکروم، رنگ آمیزی گرم و هماتوکسیلین بودند که تا به امروز چند رنگ آمیزی اختصاصی دیگر به مجوعه تکنیک های رنگ آمیزی بافت شناسی اضافه شده است. از جمله رنگ آمیزی رتیکولین که از نقره برای تشخیص فیبرهای رتیکولین استفاده می‌کند. رتیکولین‌های ساخته شده از کلاژن نوع ۳ ، در پس زمینه خاکستری تا صورتی روشن سیاه مشاهده می‌شوند. این رنگ آمیزی برای ارزیابی چنین فیبرهایی در بافت های کبد، مغز استخوان و کلیه استفاده می‌شود.

سوالات متداول

❔ رنگ آمیزی رتیکولین در بافت شناسی چه کاربردی دارد؟
✔️ از رنگ‌آمیزی اختصاصی رتیکولین جهت تشخیص و بررسی فیبرهای رتیکولین در بافت‌های مختلف حیوانات آزمایشگاهی و انسان استفاده می‌شود.

❔ کدام نمونه های بافتی مورد مطالعه با رنگ آمیزی رتیکولین قرار می‌گیرد؟
✔️ نمونه های بافتی حاوی رتیکولوم مانند کبد، طحال، مغز استخوان و کلیه با رنگ آمیزی رتیکولین مطالعه می‌شوند.