آموزش جامع رنگ‌ آمیزی اختصاصی پیکروسایروس‌ رد (Picro-Sirius red) در آزمایشگاه بافت‌شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه‌ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد در بافت‌شناسی

رنگ آمیزی پیکروسایروس رد ( Picrosirius red) یا سایروس رد یکی از انواع تکنیک های بافت‌شناسی پرکاربرد برای شناسایی و تشخیص چگونگی توزیع رشته‌های کلاژن در نمونه‌های بافتی سالم و فیبروزی توسط میکروسکوپ پلاریزه یا نوری است. پیکروسایروس رد (Picro-Sirius red; PSR) یک رنگ آنیونی قوی و هیدورفیلیک، با ساختار خطی از گروه رنگ آزو (Azo) است که شامل شش گروه سولفونات است که با رنگ کاتیونی کمپلکس فلزی ترکیب شده تا الیاف کلاژن و بافت های مرتبط را رنگ کند. تحت نور پلاریزه، گروه‌های کلاژن سبز، قرمز یا زرد به نظر می‌رسند و به راحتی از پس‌زمینه سیاه متمایز می‌شوند، بنابراین امکان تجزیه و تحلیل مورفومتریک کمی را نیز فراهم می‌کنند.

تاریخچه رنگ‌آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد

اولین بار در سال ۱۹۷۹، Junqueira و همکارانش از رنگ سایروس رد برای رنگ آمیزی بافت های مختلف ۲۰ مهره‌دار مختلف استفاده نمودند. Junqueira و گروهش طی چندین دهه از رنگ آمیزی PSR برای آنالیز کلاژن استفاده کردند. برای مثال در یک پژوهش، به بررسی شبکه فیبرهای کلاژن در بیوپسی بافت پوست بیماران مبتلا به سندروم Ehlers-Danlos با رنگ آمیزی پیکروسایروس رد پرداختند و به این نتیجه رسیدند که استفاده از سایروس رد در هیستوفوتومتری، یک آنالیز کمی از محتوای کلاژن در بافت را فراهم می کند. اندازه گیری میزان انتشار نور حاصل از رنگ نمودن کلاژن در این بافت ها، کاهش معنی داری در میزان تراکم کلاژن پوستی بیماران مبتلا به سندرم Ehlers-Danlos نسبت به گروه کنترل آنها نشان داد. نتیجه این پژوهش، استفاده از رنگ آمیزی پیکروسایروس رد به عنوان روشی سودمند برای آنالیز فیبرهای کلاژن در بافت های مختلف گردید.

انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد در بافت‌شناسی

در بافت شناسی، رنگ آمیزی سایروس رد در بخش های مختلف تشخیصی پزشکی و تحقیقاتی برای بررسی بیماری‌هایی مانند سندرم اهلرز-دانلوس و مشاهده میزان فیبروز در بسیاری از موارد التهاب ناشی از سرطان، آسیب‌های عروق خونی یا بیماری‌های متابولیکی کاربرد دارد.

نگاهی اجمالی به کلاژن رنگ شده با پیکروسایروس رد

ماتریکس‌های خارج سلولی شبکه‌های پیچیده‌ای هستند که از چهار خانواده پروتئین‌ها شامل کلاژن‌ها، الاستین، گلیکوپروتئین‌های چسبنده و پروتئوگلیکان‌ها که به یک شکل در تمام بافت‌های همبند و غشای پایه وجود دارند، تشکیل شده‌اند. بنابراین، پاتولوژی ارثی یا اکتسابی که در آن حداقل یکی از این اجزاء مختل می شود، معمولاً چندین بافت همبند را تحت تأثیر قرار می دهد و اغلب به عنوان بیماری های چند سیستمی در نظر گرفته می شود. کلاژن‌ها فراوان ترین ماکرومولکول ها در ماتریکس خارج سلولی هستند و به طور طبیعی در ماتریکس خارج سلولی پوست نیز وجود دارند. بنابراین، جهش در ژن‌های کلاژن انسانی منجر به بیماری‌های بافت همبند متعددی می‌شود و ساختار ماکرومولکولی پوست را مختل می‌کند. به عنوان مثال، سندرم اهلرز-دانلوس نوع IV (Ehlers-Danlos syndrome) یک کلاژنوپاتی است که با تشریح یا پارگی عروق مشخص می شود و بیماران دارای پوست نازک نیمه شفاف و کبودی آسان هستند.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد

در این تکنیک انواع نمونه های بافتی فریز، فیکس و تازه که دارای فیبرهای کلاژنی هستند مورد مطالع قرار می‌گیرد. این نمونه های بافتی عبارتند از ریه، رحم، عضله، کلیه، سیستم اسکلتی عضلانی، کبد، دستگاه گوارش، پوست و میوکارد.

در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد می‌پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد در بافت‌شناسی

در مراحل رنگ آمیزی سایروس رد، ابتدا هسته و سیتوپلاسم رنگ می شوند و کمپلکس فلز رنگی مانند هماتوکسیلین وایگرت (Weigert’s hematoxylin) برای مقاومت در برابر رنگ‌های اسیدی در مراحل بعدی پایدار است. مرحله دوم رنگ آمیزی، کلاژن قرمز، سیتوپلاسم و سایر مواد غنی از پروتئین را زرد رنگ می‌کند. میزان رنگ‌پذیری بر اساس اندازه مولکول و سرعت انتشار آن در محل‌های نفوذپذیر می‌باشد. تثبیت‌کننده‌هایی که میزان رنگ را افزایش می دهند منجر به ایجاد یک بخش قرمزتر می شوند، در حالی که بخش های ضخیم بافت بیشتر از قسمت های نازک زرد می شوند. علاوه بر این میزان رنگ پذیری نمونه ها تحت تأثیر عوامل مختلفی مانند زمان، دما، تثبیت، ضخامت مقطع نمونه و pH قرار می‌گیرد.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد

1. پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت‌ها را در فرمالین ده درصد یا به‌صورت فریز شده فیکس می‌کنیم.
   
2. در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت٬ها قرارداده و نام یا کد نمونه‌ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
   
3. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین از غلظت‌های افزایشی اتانول استفاده می‌شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
   
4. قالب‌گیری بافت: بلوک‌های پارافینی از نمونه‌های بافتی با پارافین جامد و طبق دستورالعمل‌های دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ تهیه می کنیم.
   
5. برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۵ الی ۱۰ میکرومتر آماده می کنیم.
   
6. آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
   
7. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ‌آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد

1. ابتدا جهت رنگ نمودن هسته، نمونه‌های فیکس شده را در جار رنگ آمیزی حاوی محلول رنگی هماتوکسیلین وایگرت (Weigert’s hematoxylin) به مدت ۸ الی ۱۰ دقیقه قرار می‌دهیم و پس از آن با آب معمولی به مدت ۱۰ دقیقه شستشو می‌دهیم.
   
2. اسلایدها را یک ساعت با محلول رنگی پیکروسایروس رد رنگ می‌کنیم و دو مرتبه لام‌ها را با آب اسیدی یا محلول استیک اسید خیلی سریع شستشو داده و لام ها را تکان می‌دهیم تا قطرات آب حذف شود.
   
3. در این مرحله نمونه ها را با اتانول مطلق دهیدراته کرده و سپس با زایلین نمونه‌ها را شفاف می‌کنیم.
   
4. لام ها را با لامل و چسب انتلان مونت نموده و نهایتا پس از اتمام مراحل رنگ‌آمیزی پیکروسایروس رد، لام‌های آماده شده را با میکروسکوپ نوری بررسی می٬کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی پیکروسایروس رد

مواد مورد نیاز

• فرمالین ده درصد
• پارافین جامد
• محلول رنگی هماتوکسیلین وایگرت
• استیک اسید
• زایلین
• اتانول مطلق
• چسب انتلان

تجهیزات مورد نیاز

• دستگاه تیشو امبدینگ
• دستگاه پارافین دیسپنسر
• دستگاه میکروتوم
• دستگاه گرمکن اسلاید
• میکروسکوپ نوری
• جار رنگ‌­آمیزی لام
• لام و لامل

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی پیکروسایروس رد

برخلاف رنگ آمیزی تری‌کروم ، رنگ آمیزی Picrosirius Red روشی استاندارد برای تشخیص کلاژن و تخمین کمی در بخش های بافت شناسی بافت‌های طبیعی و غیر طبیعی در نظر گرفته شده است. گروه‌های سولفیدی رنگ با اسیدهای آمینه بازی در مولکول های کلاژن واکنش اختصاصی می دهند و با میکروسکوپ نوری، رشته‌های کلاژن در بک‌گراند زرد کم رنگ قرمز قابل رویت است. هسته‌ها، در صورت رنگ‌آمیزی، سیاه هستند اما اغلب ممکن است خاکستری یا قهوه‌ای باشند. باید در نظر داشته باشیم که در صورت طولانی شدن زمان رنگ آمیزی با پیکرو سایروس سبب رنگ‌زدایی قابل‌توجهی از هسته‌ها می‌شود.

یکی از فاکتورهای مهمی که در نتیجه رنگ آمیزی با سایروس رد موثر است، ضخامت برش از نمونه بافتی مورد مطالعه است که تحقیقات بافت شناسی زیادی در این زمینه انجام شده است. در یک مطالعه، برشهای بافتی با ضخامت های ۴، ۷ و ۱۰ میکرومتر تهیه و رنگ آمیزی سایروس رد انجام شد و یافته‌ها نشان داد که با افزایش ضخامت مقطع بافتی برش زده، درصد کلاژن هم افزایش می‌یابد.

فیبروز کبدی نتیجه پاتولوژیک بیماری‌های التهابی مزمن کبدی است و با تکثیر سلول‌های شعاع‌دار (stellate cells) کبد و تمایز آن به سلول‌های شبه میوفیبروبلاست که ماتریکس خارج سلولی (ECM) و کلاژن را رسوب می‌کنند مشخص می‌شود. یکی از روش های مطالعه و تشخیص فیبروز کبدی استفاده از رنگ آمیزی پیکروسایروس رد در آزمایشگاه هیستولوژی است.

ارائه خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد در آزمایشگاه بافت شناسی

در هیستوپاتولوژی جهت آنالیز و تشخیص معتبر ساختار بافت‌های انسان و حیوانات آزمایشگاهی ، نمونه‌ها باید به روش صحیح و ستاپ شده، رنگ‌آمیزی شوند. یکی از انواع رنگ‌آمیزی‌های اختصاصی نمونه‌های بافتی، رنگ‌آمیزی اختصاصی انواع کلاژن در بافت های موجود زنده به نام پیکروسایروس رد است. در آزمایشگاه بافت‌شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، برش‌های میکرونی از نمونه‌های بافتی مختلف، تهیه و با تکنیک‌های رنگ‌آمیزی‌ عمومی و اختصاصی از جمله خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی پیکروسایروس رد رنگ نموده و نهایتا به بررسی و مطالعه نمونه بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح¬های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.

جمع‌بندی

کلاژن بخشی از پروتئین های ماتریکس خارج سلولی است که بخشی جدایی ناپذیر از استرومای بافت همبند را تشکیل می دهد. بنابراین نقش مهمی در حفظ یکپارچگی ساختاری و عملکردی بافت دارد که در آزمایشگاه پاتولوژی توسط رنگ های اختصاصی مانند ون گیسون و پیکروسایروس قرمز رنگ و بررسی می شود. رنگ آمیزی سایروس رد یک تکنیک بافت شناسی متداول و معتبر برای مشخص کردن کلاژن در نمونه‌های بافتی فریز و فیکس شده است. کلاژن رنگ‌آمیزی شده با رنگ PSR در میکروسکوپ نوری قرمز به نظر می رسد.

سوالات متداول

❔ رنگ آمیزی پیکروسایروس رد در بافت شناسی چه کاربردی دارد؟
✔️ از رنگ آمیزی اختصاصی سایروس رد جهت تشخیص و بررسی فیبرهای کلاژن در بافت های مختلف حیوانات آزمایشگاهی و انسان استفاده می شود.

❔ کدام نمونه های بافتی مورد مطالعه با رنگ آمیزی پیکروسایروس رد قرار می گیرد؟
✔️ بافت های پوست، عروق خونی، کبد، قلب، ریه، رحم، سیستم اسکلتی-عضلانی و غیره با رنگ آمیزی سایروس رد مطالعه  می­شوند