⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند
مقدمه‌ای از رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف در بافت‌شناسی
رنگ‌آمیزی ورهاف یا ورهوف (Verhoeff) برای رنگ آمیزی الیاف الاستیک و الاستین در بخش‌های برخی بافت‌ها در بافت شناسی استفاده می‌شود. این رنگ با نام‌های Verhoeff˙s elastic staining (VEG) ، Verhoeff–Van Gieson staining (VVG) نیز شناخته شده است. رنگ ورهاف انواع پیوندهای کاتیونی، آنیونی و غیریونی را با الاستین، تشکیل می دهد. فیبرهای الاستیکی به کمپلکس‌های آهن – هماتوکسیلینی که توسط معرف٬های موجود در رنگ ایجاد می شود، تمایل زیاد دارد و از این رو سبب می شود الاستین رنگ شده بماند در حالی که اجزای دیگر بافت رنگ را از دست می‌دهند. در این روش رنگ آمیزی معمولا تیوسولفات سدیم برای از بین بردن ید اضافی و یک ضد رنگ (اغلب رنگ Van Gieson) برای تضاد رنگ اصلی استفاده می شود.
تاریخچه رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف
Ira Van Gieson برای اولین بار پروتکل رنگ آمیزی ورهاف Verhoeff-van Gieson (VVG) را در سال ۱۸۸۹ به عنوان روشی برای ارزیابی رشته‌های کلاژن در بافت عصبی توصیف کرد. فردریک هرمان ورهاف (Frederick Herman Verhoeff)، جراح و آسیب شناس آمریکایی، سپس در سال ۱۹۰۸ این رنگ را به عنوان روشی برای تمایز کلاژن و سایر بافت های همبند، و به ویژه متمایز کردن الیاف الاستیک اصلاح کرد.
انواع کاربردهای رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف در بافت‌شناسی
رنگ‌آمیزی ورهاف بافت الاستیک در تشخیص پاتولوژی و تحقیقات بافت شناسی بیماریهای متنوع مرتبط با الاستین مانند آمفیزم یا آتروفی بافت الاستیک (Emphysema)، تصلب شرایین (نازک شدن و از بین رفتن الیاف الاستیک)، پیری (Aging) و سایر بیماریهای عروقی مفید است. با افزایش سن، تغییراتی مانند شکافتن و تکه‌تکه شدن فیبرهای الاستیک اتفاق می‌افتد، این تغییرات در پوست بصورت علائم چروکیده و نسبتاً شل نشان داده می‌شود. علاوه بر بررسی تغییرات ساختاری فیبرهای الاستین در بیماری‌ها با رنگ‌آمیزی ورهاف، برای تحقیق و آنالیز تاثیرات مواد شیمیایی، گیاهی و داروهای سنتز شده بر الاستین‌ها در بیماریهای ذکر شده نیز کاربرد دارد.
نگاهی اجمالی به فیبرهای الاستیک رنگ شده با ورهاف
الاستین یا فیبرهای زرد یک پروتئین ماتریکس خارج سلولی (ECM) هستند که مسئول انبساط و کشش بسیاری از بافت‌های مهره‌داران، مانند شریان‌های بزرگ، دریچه‌های قلب، بافت‌های ریوی، پوست و برخی رباط‌ها و غضروف‌ها می‌باشند. برای مثال فیبرهای الاستیک فراوانی در آئورت وجود دارند که انعطاف پذیری زیادی را برای این رگ خونی بزرگ فراهم می‌کنند. الیاف الاستیک که محصولات مونومرهای تروپوالاستین (tropoelastin) به صورت آنزیمی و پروتئین های میکروفیبریلار هستند، از یک هسته الاستین پلیمریزه نامحلول و میکروالیاف واقع در حاشی‌ها تشکیل شده اند. الاستین در بافت های الاستیک به وفور یافت می شود و بافت های غنی از الاستین شامل آئورت و رگ های خونی اصلی (۲۸ تا ۳۲ درصد)، ریه ها (۳ تا ۷ درصد)، رباط های الاستیک (۵۰ درصد)، تاندون ها (۴ درصد)، و پوست (۲-۳%) هستند. اسیدهای آمینه اصلی تشکیل دهنده الاستین، پرولین، گلایسین، دسموزین و ایزودسموزین هستند. آنها در توالی های کوتاه و مکرر از سه تا نه اسیدآمینه گروه‌بندی می شوند که ساختارهای قوی و انعطاف پذیری ایجاد می کنند.
انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف
رنگ آمیزی Verhoeff روی بافت های فیکس شده در هر فیکساتوری قابل انجام است، اگرچه فیکساتورهای مبنی بر فرمالین بیشتر در این تکنیک موفق هستند. کلیه نمونه‌های بافتی که دارای فیبر الاستیک هستند مانند پوست، قلب، ریه، عروق خونی، رحم و غیره بصورت فریز و فیکس از انسان،حیوانات آزمایشگاهی و همچنین سایر موجودات زنده قابل انجام می‌باشد.
در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی ورهاف می‌پردازیم.
پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف در بافت‌شناسی
جهت انجام مراحل رنگ آمیزی ورهاف پروتکل‌های مختلفی موجود می باشد که در این مقاله به یکی از پروتکل‌ها می‌پردازیم.
مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی ورهاف
- پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت‌ها را در فرمالین ده درصد یا بصورت فریز شده فیکس می‌کنیم.
- در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت‌ها قرارداده و نام یا کد نمونه‌ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
- آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین از غلظت‌های افزایشی اتانول استفاده می‌شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت میگردد.
- قالب‌گیری بافت: بلوک‌های پارافینی از نمونه‌های بافتی با پارافین جامد و طبق دستورالعمل‌های دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ تهیه می‌کنیم.
- برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش٬های نازک در حد ۵ الی ۱۰ میکرومتر آماده می کنیم.
- آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
- اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌آمیزی رنگ می‌کنیم.
مراحل رنگ‌آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی ورهاف
- نمونه‌های فیکس شده را در جار رنگ‌آمیزی حاوی محلول رنگی ورهاف به مدت ۶ الی ۱۰ دقیقه در دمای ۶۰ درجه فور قرار می‌دهیم.
- اسلایدها را سه دقیقه با پروپیلن گلیکول ۸۵% تیمار نموده و پس از آن با آب مقطر شستشو می‌دهیم.
- در این مرحله می‌توانیم از رنگ نوکلئار فست رد جهت رنگ نمودن هسته سلول‌ها استفاده نماییم.
- لام ها را با لامل و چسب انتلان مونت نموده و نهایتا پس از اتمام مراحل رنگ آمیزی ورهاف، لام‌های آماده شده را با میکروسکوپ نوری بررسی می‌کنیم.
تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی ورهاف
مواد مورد نیاز
- پودر رنگ ورهاف
- پروپیلن گلیکول
- فرمالین
- آب مقطر
- چسب انتلان
- رنگ نوکلئار فست رد
تجهیزات مورد نیاز
- میکروسکوپ نوری
- جار رنگ‌آمیزی لام
- لام و لامل
- فور
- کاغذ صافی
جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.
تفسیر نتایج رنگ‌آمیزی ورهاف
الیاف الاستیک با روش‌های رنگ٬آمیزی روتین مانند هماتوکسیلین و ائوزین مقاطع بافتی به خوبی متمایز نمی شوند. ممکن است در رنگ آمیزی H&E تا حدودی قابل بررسی باشد، اما اغلب نمی توان به وضوح از رشته٬های کلاژن و ماهیچه های صاف تشخیص داد. اما رنگ آمیزی ورهاف تجسم این ساختارهای ظریف الاستیک را در زیر میکروسکوپ نوری امکان‌پذیر می‌سازد. این روش منجر به رنگ آمیزی الیاف و هسته‌های الاستیک به رنگ سیاه و آبی، کلاژن به رنگ قرمز و اجزای سیتوپلاسمی به رنگ زرد می شود.
یکی از رنگ‌هایی که همزمان با رنگ‌آمیزی ورهاف قابل انجام است، پروتکل تری کروم ماسون است. ترکیب ماسون-ورهاف برای بررسی رگ های خونی مفید است. رنگ ورهاف الاستین (سیاه) را برجسته می کند اگرچه رنگ ماسون منجر به رنگ متضاد فیبرهای عضلانی و کراتین قرمز می شود، در حالی که کلاژن و استخوان به رنگ سبز یا آبی می شوند. استفاده از این تکنیک رنگ آمیزی ترکیبی بیشترین کاربرد را برای مطالعه پاتولوژی های عروقی مثل انسداد شریان قلب دارد و می توان برای تمایز شریان هایی که دارای دو یا چند لایه الاستیک هستند از وریدهایی که دارای الاستیک منفرد هستند، استفاده کرد. در نتیجه به پاتولوژیست این امکان را می‌دهد تا به راحتی شریان های کوچک (که معمولاً دارای دو لایه الاستیک هستند) و وریدها (که دارای یک لایه الاستیک هستند) را تشخیص دهد.
ارائه خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف در آزمایشگاه بافت شناسی
بافت شناسی، سیتولوژی و سایر رشته های علمی مرتبط، آناتومی میکروسکوپی بافت ها و سلول ها را مطالعه می‌کنند. برای دستیابی به ساختار بافتی و سلولی، نمونه‌ها باید به روش صحیح، رنگ‌آمیزی شوند. یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه‌های بافتی، رنگ‌آمیزی اختصاصی انواع الاستین در بافت های موجود زنده از جمله حیوان آزمایشگاهی به نام رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف است.
در آزمایشگاه بافت‌شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، برش‌های میکرونی از نمونه‌های بافتی مختلف، تهیه و با تکنیک‌های رنگ‌آمیزی عمومی و اختصاصی از جمله خدمات رنگ‌آمیزی اختصاصی ورهاف رنگ نموده و نهایتا به بررسی و مطالعه نمونه بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح‌های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.
جمع‌بندی
رنگ آمیزی ورهاف به طور گسترده برای اهداف تشخیصی و تحقیقاتی هیستوپاتولوژی استفاده می شود. در آزمایشگاه های تشخیصی پزشکی، رنگ ورهاف برای شناسایی وجود یا عدم وجود الیاف الاستیک در بافت ها استفاده می شود. به عنوان مثال، پاتولوژیست‌ها ممکن است از آن برای تشخیص از دست دادن بافت الاستیک در ریه بیماران مبتلا به آمفیزم (emphysema) و نازک شدن و از دست دادن فیبرهای الاستیک در رگ‌های خونی بیماران مبتلا به تصلب شرایین استفاده کنند.
سوالات متداول
❔ رنگ آمیزی ورهاف (Verhoeff) در بافت شناسی چه کاربردی دارد؟
✔️ رنگ آمیزی ورهاف ساختارهای الاستیک در نمونه های بافتی مختلف مانند پوست، ریه، عروق خونی را متمایز می کند.
❔ کدام نمونه های بافتی مورد مطالعه با رنگ آمیزی ورهاف قرار می گیرد؟
✔️ بافت هایی که دارای فیبرهای الاستیک هستند مانند پوست، انواع عروق، ریه و بافت رحم با تکنیک ورهاف مطالعه می شود.
دانلود PDF
