استخراج پلاسمید از باکتری

استخراج پلاسمید از باکتری، پلاسمید یک دئوکسی ریبونوکلئیک اسید می باشد که به طور مستقل از DNA کروموزومی کپی می شود و امروزه در علم بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک به وفور استفاده می شود.

اولین بار پلاسمید توسط  Joshua Lederberg، برنده جایزه نوبل شناسایی شد. پلاسمید یک دئوکسی ریبونوکلئیک اسید کوچک حلقوی خارج کروموزومی (DNA) است که به طور مستقل از DNA کروموزومی کپی می شود. اکثرا میزبان پلاسمید، باکتری می باشد. پلاسمید در زیست شناسی مولکولی، بیوشیمی، بیوتکنولوژی، زیست سلولی کاربرد گسترده ای دارد. این بدان معنی است که خالص سازی / جداسازی پلاسمید یک آزمایش اساسی در زمینه های تحقیقاتی است و این آزمایش تقریباً در هر آزمایشگاه روزانه انجام می شود.

پلاسمید DNA حلقوی

خاصیت شیمیایی پروتئین با اسیدهای نوکلئیک کاملاً متفاوت است. بنابراین، جدا کردن اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها نسبتاً آسان است. با این حال، RNA و DNA مولکول های بسیار مشابهی با یکدیگر هستند. در میان آن ها، ریبوز موجود در RNA تنها از طریق ساختار گروهی از یک گروه هیدروکسیل (−OH) از دی اکسی ریبوز در DNA قابل تشخیص است. علاوه بر این، DNA کروموزومی و DNA پلاسمید هر دو اسیدهای دی اکسی ریبونوکلئیک هستند که دارای خواص شیمیایی یکسانی هستند. DNA کروموزومی و پلاسمید تقریباً در همه باکتری ها بصورت دایره ای است.

تفاوت قابل تشخیص آنها فقط اندازه آنهاست: DNA پلاسمید (۱۰ ~ جفت باز پایه) بسیار کوچکتر از DNA کروموزومی (برای مثال ۴.۶ میلیون جفت باز در اشرشیاکلی) است. بر اساس این ویژگی ها، تکنیک ویژه ای برای استخراج DNA پلاسمید در بین این مولکول های زیستی مورد نیاز است.

روش استخراج پلاسمید از باکتری

جوشاندن boiling

روش های بسیاری برای استخراج پلاسمید از باکتری وجود دارد که آسان ترین و کم هزینه ترین، روش جوشاندن (boiling) می باشد. در این روش، محلول STET (شامل 100mM سدیم کلرید، 10mM Tris-HCL(pH:8.0)، 1mM EDTA، ۵% Triton-X یا Tween 20) به پلیت باکتری اضافه می شود. در مرحله بعد، نمونه به مدت ۱۵ دقیقه در ۱۰۰ درجه سانتی گراد می جوشد و سپس سانتریفیوژ می شود. مایع رویی بیرون ریخته می شود و سپس آب مقطر به نمونه اضافه می شود.

پس از جداسازی DNA، پلاسمید از بقایا و رسوب DNA با افزودن الکل، جدا می شود و نمونه نهایی پلاسمید برای آزمایش های بعدی مانند برش پلاسمید توسط آنزیم محدود کننده آماده می شود.

معایب این روش

• آلودگی RNase، DNase، پروتئین و .. وجود دارد.
• DNA دو رشته ای از هم باز می شود. (اگر DNA تک رشته ای باشد، در روش shut down cloning کاربرد ندارد)

نکته: روش boiling برای باکتری های باسیلوس ها و استاف ها کاربرد ندارد، چون پپتیدوگلیکان ضخیم دارند و اکثر باسیلوس ها اسپور تشکیل می دهند.

برای تعیین غلظت DNA، از دستگاه نانودراپ استفاده می شود که نسبت ۲۶۰/۲۸۰ مورد بررسی قرار می گیرد. اگر این نسبت در محدوده ۹/۱-۸/۱ باشد یعنی DNA از کیفیت خوبی برخوردار است و خالص می باشد. درحالی که اگر این محدوده کمتر از ۸/۱ باشد، در نمونه پروتئین هم وجود دارد و اگر بیشتر از ۲ باشد، RNA وجود دارد.

حذف RNA

به منظور حذف RNA از نمونه، ریبونوکلئاز (RNase) استفاده می شود.

حذف RNase توسط فنل / کلروفرم

فنل یا فنل / کلروفرم به عنوان یک دناتوراه کننده پروتئین شناخته شده است که RNase نیز توسط دناتوره کننده، غیرفعال می شود. از آنجا که RNase بسیار پایدار است، تکرار مراحل اضافه کردن فنل یا فنل / کلروفرم برای حذف کامل RNase موثرتر است.

نمک ها به عنوان عامل رسوب اسید نوکلئیک

مشخص شده است که نمک های خاصی، اسیدهای نوکلئیک را به طور انتخابی رسوب می دهند که این نمک ها را می توان برای استخراج DNA پلاسمید استفاده کرد.

کلسیم کلرید (CaCl2)

رسوب RNA در غلظت حدود ۱ میلی متر صورت می گیرد، اما DNA در این شرایط رسوب نمی کند.

کلرید لیتیوم (LiCl)

کلرید لیتیوم (LiCl) در غلظت نهایی ۲.۵ میلی متر ما را قادر می سازد تا RNA را به طور انتخابی رسوب دهیم.

نکته: روش افزودن LiCl  نسبت به کلرید کلسیم (CaCl2) گران تر است.

کلرید سزیم (CsCl)

 

روش اولترا سانتریفیوژ کلرید سزیم (CsCl) نیازی به RNase ندارد. این بدان معناست که در آزمایش نیازی به استفاده فنل / کلروفرم نیست ، بنابراین DNA پلاسمید خالص شده با این روش تقریباً برای همه آزمایش های بیوشیمیایی مناسب است.

در این روش پلاسمید خالص بدست می آید، اگرچه برای تجهیزات نیاز به یک سانتریفیوژ گران قیمت می باشد. علاوه بر این، مدت زمان زیادی (تقریباً یک شب) برای سانتریفیوژ مورد نیاز است و از اتیدیم بروماید (EtBr) با غلظت بسیار بالا (۸۰۰ میکروگرم در میلی لیتر) استفاده می شود. سانتریفیوژ به مدت ۱۶ ساعت و در ۲۰ درجه سانتیگراد با دور ۲۰۰۰۰۰ ، انجام می شود.

در این آزمایش ، باید از لوله مخصوص استفاده شود. لوله سانتریفیوژ از یک پلیمر پلاستیکی نرم و نیمه شفاف ساخته شده است و DNA پلاسمید به صورت یک باند در لوله ظاهر می شود. یک سوزن سرنگ به داخل لوله وارد می شود و باند پلاسمید جدا شده به داخل سرنگ مکیده می شود و به لوله جدید منتقل می شود. این آزمایش به غلظت CsCl بسیار حساس است و تغییر جزئی مقدار CsCl باعث نتیجه منفی می شود.

روش اولترا سانتریفیوژ CsCl گران است زیرا CsCl معرف گران قیمت است. علاوه بر این، این آزمایش زمانبر، خطرناک و دشوار است. در مقابل، با استفاده از این روش، می توانیم مقدار زیادی DNA پلاسمید فوق خالص به دست آوریم. این روش حتی می تواند ccDNA را از ocDNA جدا کند.

کیت های استخراج پلاسمید از باکتری

امروزه کیت های بسیاری در بازار به منظور استخراج پلاسمید از باکتری وجود دارد که کیت شرکت Qiagen به دلیل کیفیت فوق العاده ستون آن بسیار مشهور می باشد. در بروشور این کیت ها روش انجام به طور کامل ذکر شده است.

مطالب مرتبط: بررسی و اندازه گیری بیوفیلم باکتریایی – سیانوباکترها و نانو ذرات – روش تعیین حداقل غلظت ممانعت کنندگی (M.I.C)
خدمات مرتبط‌: خدمات میکروبیولوژی – ایجاد انواع مدل های حیوانی بر اساس آخرین مقالات روز دنیا