آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ (Acridine Orange) در آزمایشگاه بافت‌شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه ای از رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ در بافت شناسی

رنگ آکریدین اورانژ (Acridine Orange یا AO) یک رنگ فلوروکروم با خاصیت بازی ضعیف، چربی‌دوست است که قادر به نفوذ در ساختار غشای سلولی و اندامک‌ها است. اگرچه کاملاً به شکل خنثی در سلول نفوذ می کند، پس از باردار شدن، این رنگ ها تمایل دارند در سمت pH پایین سد غشایی به دام بیافتند که منجر به تجمع آنها در ساختارهای اندامک اسیدی مانند لیزوزوم‌ها و فاگولیزوزوم٬ها می شود. این رنگ متصل شونده به نوکلئیک اسید هنگامی که به DNA دو رشته ای متصل می‌شود، رنگ فلورسنت سبز ساطع می‌کند و با اتصال به DNA تک رشته‌ای و RNA، فلورسنت قرمز را منتشر می‌کند. این ویژگی منحصر به فرد رنگ آکریدین اورنج سبب استفاده گسترده آن در مطالعات سلولی شده است.

تاریخچه رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ

آکریدین اورنج یا AO عضوی از گروه آمینواکریدین مشتق شده است و ساختار آروماتیک مشترکی با چندین رنگ آکریدین دارد. آکریدین اورانژ اولین بار در اواخر قرن نوزدهم توسط کارل گراب و هاینریش کارو (Carl Grabe و Heinrich Caro) از زغال سنگ استخراج شد و سپس برای مدتی به عنوان رنگ در صنعت پارچه و همچنین برای کاربردهای بیولوژیکی استفاده شد. در سال ۱۹۱۲، ارلیش و بندا (Erlich و Beneda) پیشنهاد کردند که از آکریدین‌ها به عنوان ضدمالاریا استفاده شود، بنابراین از جانب گروهی از محققین پیشنهاد داده شد که از آکریدین اورانژ به عنوان یک عامل ضد میکروبی حدود یک دهه استفاده شود. در طول جنگ جهانی اول و دوم، قبل از استفاده گسترده از پنی سیلین، رنگ های آکریدین به طور گسترده ای به عنوان عامل ضد میکروبی مورد استفاده قرار گرفتند. امروزه از رنگ آکریدین اورنج در تحقیقات و تشخیص‌های پاتولوژی و پزشکی استفاده می شود.

انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ در بافت شناسی

آکریدین اورانژ به علت داشتن خواص متاکروماتیکی معمولاً در تجزیه و تحلیل میکروسکوپ فلورسنت و فلوسیتومتری فیزیولوژی سلولی و وضعیت چرخه سلولی انواع سلول‌ها استفاده می شود. به عبارت دیگر آکریدین اورنج جهت تشخیص مراحل آپوپتوز، نکروپتوز (necroptosis) و نکروز استفاده می شود. در طی آپوپتوز، سلول‌ها با آکریدین اورنج رنگ می‌شود و انقباض هسته‌ای، تکه تکه شدن سلولی و از دست دادن مرزبندی هسته‌ای را نشان می‌دهند.

کاربرد دیگر رنگ آمیزی آکریدین اورانژ در باکتری‌شناسی برای تشخیص باکتری مانند هلیکوباکتر پیلوری ، مایکوپلاسما در نمونه‌های بالینی بافتی و مایعات بدن می‌باشد. رنگ آمیزی آکریدین اورنج نیز در حوزه انکولوژی به عنوان یک رنگ فلوروسنت در مطالعات بالینی سلول‌های سرطانی بویژه در تصویربرداری سرطان و درمان فوتودینامیک استفاده می‌شود.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ

نمونه‌هایی که با روش آکریدین اورنج مطالعه می‌شوند، متنوع هستند. از جمله این نمونه‌ها می‌توان به انواع بافت های بدن مثل سیستم عصبی، معده، تومورهای ماست سل (mast cell tumors)، مایعات بدن مثل مغز استخوان، مایع مغزی نخاعی (CSF)، مایع سینوویال، مایع صفاقی، انواع سلولهای جدا شده از بدن انسان و حیوانات آزمایشگاهی و همچنین سلول‌های کشت داده شده در محیط آزمایشگاهی اشاره نمود.

در این مقاله به یکی از پروتکل‌های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورانژ می‌پردازیم.

پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ در بافت‌شناسی

مراحل رنگ آمیزی آکریدین اورنژ برای سلول و نمونه بافتی فیکس شده در فرمالین یا بافت تازه در مراحل آماده سازی لام از نمونه متفاوت است.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ

1. پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت‌ها را در فرمالین ده درصد فیکس می‌کنیم.
2. در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت‌ها قرارداده و نام یا کد نمونه‌ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
3. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با غلظت‌های افزایشی اتانول این مرحله انجام می‌شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می‌گردد.
4. قالب‌گیری بافت: بلوک‌های پارافینی از نمونه‌های بافتی با استفاده از دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ و پارافین جامد انجام می‌دهیم.
5. برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۵ الی ۲۰ میکرومتر تهیه می‌کنیم.
6. آبدهی نمونه برش‌زده: برش‌های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می‌کنیم.
7. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌آمیزی رنگ می‌کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ

1. یک گرم از پودر آکریدین اورانژ را در یک لیتر آب دو بار تقطیر حل می‌کنیم و به عنوان استوک اصلی در ظرف شیشه‌ای تیره نگهداری می‌کنیم. برای تهیه working solution یک سی‌سی از استوک اصلی و نیم سی‌سی استیک اسید گلسیال به ۵۰ سی‌سی آب مقطر اضافه و ترکیب می‌کنیم.
2. اسلایدهای حاوی نمونه بافتی فیکس شده را در جار لام حاوی محلول آکریدین اورانژ با pH: 1.2 به مدت ۳۰ دقیقه و در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار می‌دهیم. برای ستاپ غلظت ایده‌آل رنگ آکریدین اورانژ، چند اسلاید را با غلظت های مختلف از رنگ، رنگ آمیزی کرده و با میکروسکوب فلوئورسنت بررسی می‌کنیم و بهترین غلظت را به عنوان غلظت اصلی انتخاب می‌کنیم.
3. سپس به مدت ده دقیقه با آب مقطر لام‌ها را شستشو می‌دهیم.
4. از پروتکل رنگ آمیزی هوخست (Hoechst) میتوان برای رنگ آمیزی هسته سلول‌ها استفاده کنیم.
5. پس از خشک شدن لام‌ها، با چسب انتلان و لامل نمونه‌ها را مونت کرده و با میکروسکوپ فلورسنت بررسی می‌کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی آکریدین اورنژ

مواد مورد نیاز

• اتانول مطلق
• پارافین
• آب مقطر
• فرمالین ده درصد
• چسب انتلان
• استیک اسید
• پودر آکریدین اورانژ

تجهیزات مورد نیاز

• میکروسکوب فلورسنت
• دستگاه میکروتوم
• دستگاه گرمکن اسلاید بافتی
• دستگاه پارافین دیسپنسر 
• دستگاه تیشو امبدینگ
• جار رنگ‌­آمیزی لام
• لام و لامل

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ آمیزی آکریدین اورنژ

رنگ آمیزی آکریدین نارنجی و پروپیدیوم یدید (رنگ آمیزی Acridine orange/Propidium iodide) رنگ‌های زیست‌پذیری سلولی هستند که آکریدین اورنج سبب می٬شود سلول های هسته‌دار زنده به رنگ سبز و سلول های هسته‌دار غیر زنده به رنگ قرمز فلورسانس رنگ کنند. آکریدین اورنج به سلول‌های زنده نفوذ کرده و به اسیدهای نوکلئیک متصل می شود. اتصال به dsDNA باعث فلورسانس سبز آکریدین نارنجی و اتصال به ssDNA یا RNA باعث فلورسانس قرمز آن می شود. پروپیدیوم یدید نیز به اسیدهای نوکلئیک متصل می‌شود. اما تفاوت آن با آکریدین اورنج این است که پروپیدیوم یدید قادر به نفوذ به غشای سلولی دست نخورده نیست، توسط سلولهای غیر غیرزنده و سلول هایی با غشاهای آسیب دیده جذب می شود. هنگامی که به اسیدهای نوکلئیک متصل می شود، فلورسانس آن ۲۰-۳۰ برابر می شود و باعث فلورسانس قرمز سلول می شود.

هلیکوباکتر پیلوری یک باکتری گرم منفی میکروآئروفیل است که در اپیتلیوم معده حداقل ۵۰ درصد از جمعیت جهان کلنی کرده است و در ایجاد گاستریت مزمن، زخم معده، زخم دوازدهه و آدنوکارسینوم معده نقش دارد. از این رو شناسایی این باکتری با تکنیک های آزمایشگاهی معتبر حائز اهمیت می‌باشد. اثربخشی رنگ آکریدین اورانژ در شناسایی هلیکوباکتر پیلوری در اسمیر بیوپسی بزرگسالان مبتلا به بیماری گوارشی توسط محققان مطالعه شده و نتایج به ‌دست‌آمده نشان می‌دهد که رنگ آمیزی آکریدین اورنج می‌تواند جایگزین رنگ‌آمیزی گرم (Gram Stain) در شناسایی ارگانیسم این باکتری در نمونه مخاط معده و دوازدهه شود.

ارائه خدمات رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ در آزمایشگاه بافت شناسی

انواع روشهای رنگ‌آمیزی از تکنیک های رایج در آزمایشگاه بافت‌شناسی است و برای ایجاد تمایز بین اجزای مختلف بافت‌ها و سلولها جهت آنالیز دقیق نمونه ها استفاده می‌گردد. یکی از انواع رنگ‌آمیزی‌های اختصاصی نمونه‌های بافتی، مایعات بدن و سلولهای مختلف، رنگ آمیزی اختصاصی آکریدین اورنژ یا آکریدین اورنج است.
آزمایشگاه بافت شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، آماده ارائه خدمات رنگ آمیزی آکریدین اورنج برای انواع نمونه های انسانی و حیوانات آزمایشگاهی برای طرح٬های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می باشد.

جمع بندی

رنگ‌آمیزی نمونه های بافتی یک تکنیک استاندارد و قابل استناد برای تشخیص پزشکی و تحقیقات هیستوپاتولوژی بسیاری از بیماری‌ها است، زیرا اساس این تکنیک آنالیز نمونه‌ها با میکروسکوپ نوری و فلورسنت است. رنگ آمیزی آکریدین اورنج مدتهاست در تحقیقات بافت و سلولی به عنوان تکنیکی قدرتمند شناخته شده است. تغییرات در مقدار pH داخل لیزوزومی نمونه های بافت و سلول را می توان با استفاده از رنگ های وابسته به pH از جمله آکریدین اورنج مطالعه کرد.

سوالات متداول

❔ رنگ آمیزی آکریدین اورنج برای مطالعه کدام مرحله چرخه سلولی سلول‌ها استفاده می شود؟
✔️ از آکریدین اورنج برای بررسی آپوپتوز، نکروز سلولها در اثر تیمار با داروها و مواد مختلف استفاده می‌شود.

❔ تفاوت رنگ آمیزی آکریدین نارنجی با رنگ‌آمیزی پروپیدیوم یدید چیست؟
✔️ آکریدین اورنج قابلیت نفوذ به داخل سلولها از غشای سلولی کامل و دست نخورده را دارد ولی پروپیدیوم یدید این توانایی را ندارد و تنها سلول‌های با غشای آسیب‌دیده را رنگ می کند.