بررسی و اندازه گیری بیوفیلم باکتریایی در باکتری هایی که توانایی چسبیدن به سطوح را دارند به ویژه در ارگانیسم های پاتوژن که از این خاصیت برای ایجاد بیماری استفاده می کنند بسیار مهم است.
بعضی از میکروارگانیسم ها از این پدیده استفاده می کنند تا بتوانند خود را از اثرات و نیروهای زیان بار محیط طبیعی و بدن میزبان حفظ کرده و بدین گونه شانس بقای خود را افزایش دهند؛ زیرا وقتی باکتری ها تشکیل بیوفیلم می دهند مقاومت آن ها نسبت به شرایط نامساعد محیطی و بیوسایدها زیاد می شوند، از این رو مسئله بیوفیلم ها در امر پزشکی و صنعت به یک معظل تبدیل شده است.
بیوفیلم های باکتریایی منبع عفونت های سیستمیک مقاوم به درمان مانند عفونت های مجرای ادراری، عفونت های کاتتری، عفونت های مزمن در اندوکردیت، عفونت های پوشش لنزهای تماسی، عفونت های گوش میانی کودکان، عفونت های دریچه قلبی و کاشت های جراحی می باشند.
تشکیل بیوفیلم در ایزوله های باکتریایی جداسازی شده از بیماران استفاده کننده از ابزارهای خارجی، به ویژه بیماران بستری در بخش های ارتوپدی شایع تر می باشد. بیوفیلم ساختاری متشکل از یک جمعیت باکتریایی است که به وسیله یک ماتریکس اگزوپلی مری تولید شده توسط باکتری محصور شده است. این ویژگی به باکتری توانایی اتصال به سطوح مختلف و همچنین افزایش مقاومت ذاتی به آنتی بیوتیک ها را می دهد.
باکتری های مهم تولید کننده بیوفیلم
بررسی و اندازه گیری بیوفیلم باکتریایی از این رو حائز اهمیت است که برخی از باکتری ها سازنده بیوفیلم از لحاظ پزشکی و صنعتی دارای کاربرد های بیشتری بوده و مطالعات فراوانی بر روی آن ها صورت گرفته است. از جمله باکتری های مهم گرم مثبت می توان به استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوک اورئوس، انتروکوک ها و از جمله باکتری های گرم منفی می توان به سودوموناس فاورسنس، سودوموناس آئروژینوزا، اشرشیاکلی، ویبریوکلرا، اسینتوباکتر بومانی و کلبسیلا پنومونیه اشاره نمود. کلبسیلا از دسته باسیل گرم منفی، غیرمتحرک و دارای کپسول پلی ساکاریدی می باشد. کلبسیلا پنومونیه پنجمین عامل شایع و عامل ۵/۷-۵ درصد کل عفونت های بیمارستانی بوده که میزان مرگ و میر ناشی از باکتری کلبسیلایی ۲۰ تا ۵۰ درصد گزارش شده است. در مطالعات صورت گرفته توسط اسکن تشعشع میکروسکوپ الکترونی و ریزبینی دوچشمی لیزری توانائی سویه های کلینیکی کلبسیلا پنومونیه در چسبیدن و تشکیل بیوفیلم ثابت شده است.
ارزیابی فنوتیپی تولید بیوفیلم
تشکیل کلنی، رشد سلول باکتری و تشکیل ماتریکس های بیوفیلمی فشرده میکروبی و مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری ها را در مقابل سیستم دفاعی میزبان مقاوم می کند؛ اما نانوذرات از تشکیل این عوامل دفاعی میکروب در برابر سیستم ایمنی میزبان جلوگیری می کنند پس می توانند گزینه بسیار مناسبی برای مهار و از بین بردن این باکتری ها باشند.
روش بررسی و اندازه گیری بیوفیلم باکتریایی در استافیلوکوک اورئوس
برای بررسی و اندازه گیری بیوفیلم باکتریایی ، کلنی های استافیلوکوکوس اورئوس غنی سازی شده روی محیط TSB (تریپتیکاز سوی براث) حاوی یک درصد گلوکز کشت داده می شود و به مدت ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه می شود. بعد از ۲۴ ساعت میکروپلیت ها به آرامی سه بار با محلول استریل PBS شست و شو داده شد و پلیت به صورت وارونه روی کاغذ صافی قرار گرفته تا خشک شود. سپس برای تثبیت از متانول استفاده و به میزان ۱۰۰ میکرولیتر به همه توده ها متانول اضافه و ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار می گیرد. بعد از گذشت این زمان و خارج کردن الکل و خشک کردن پلیت در شرایط اتاق، به همه خانه های پلیت ۱۰۰ میکرولیتر از رنگ کریستال ویوله یک درصد اضافه و به مدت ۲۰ دقیقه در شرایط اتاق قرار داده می شود. سپس رنگ باند شده با ۱۵۰ میکرولیتر از اسید استیک ۳۳ درصد آزاد شده و آماده قرائت با طول موج ۴۹۲ نانومتر در دستگاه الایزا ریدر می شود. از محیط کشت به تنهایی به عنوان کنترل منفی استفاده می شود.
نحوه ارزیابی بیوفیلم در جدول زیر آورده شده است
| میزان شدت رنگ سنجی | نحوه ارزیابی |
| OD<ODC | عدم تشکیل بیوفیلم |
| ODC<OD<2×ODC | ضعیف |
| ۲ ×ODC < OD<4×ODC | متوسط |
| ۴ ×ODC | قوی |
ارزیابی ژنوتیپی تولید بیوفیلم
در باکتری ها، تولید بیوفیلم ناشی از فعالیت اپرونی تحت عنوان ica ABCD می باشد که مهم ترین عامل برای تشکیل ماتریکس اگزو پلی ساکاریدی و از عوامل چسبندگی بین سلولی PIA است. ژن های ica A، ica B، ica C و icaD توسط سیستم های تنظیمی متعددی کنترل می شوند. این سیستم های تنظیمی شامل Sar A و سیگما B است. علاوه بر سیستم اپرون ica ABCD، سیستم agr نیز در ایجاد بیوفیلم نقش دارد. از میان ژن های لوکوس ica، ica A و icaD نقش بیشتری در تشکیل بیوفیلم در استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بازی می کنند.
بیوفیلم باکتری کلبسیلا
یکی از فاکتورهای موثر در بیماریزایی کلبسیلا پنومونیه، توانایی تشکیل بیوفیلم است که موجب افزایش مقاومت در برابر عوامل دفاعی میزبان و عوامل ضد میکروبی می شود. علاوه بر این، باکتری کلبسیلا پنومونیه به واسطه داشتن فاکتورهای ویرولانس مختلف، از توانایی تولید طیف وسیعی از عفونت ها برخوردار می باشد. تولید بیوفیلم و توانایی اتصال به بافت های میزبان در کلبسیلا پنومونیه توسط ژن های مختلفی مانند ( wbbm ،pgaA ،mrkA و wzm ) کد گذاری می شود. حضور این ژن ها در کلبسیلا پنومونیه منجر به تولید عفونت های شدیدتری در بیماران شود.
روش ژنوتیپی شناسایی بیوفیلم
به منظور شناسایی ژن های markA ،pgaA ، wzm و wbbm ابتدا از نمونه مورد نظر، توسط کیت و یا روش های مختلف مانند boiling، استخراج DNA صورت می گیرد و سپس واکنش PCR توسط دستگاه ترموسایکلر انجام می شود. در ادامه محصولات تکثیر شده بر روی ژل آگارز ۱ درصد با ولتاژ ۹۵ به مدت ۳۰ دقیقه الکتروفورز می شوند و سپس توسط دستگاه GEL doc تحت تاثیر اشعه UV با طول موج ۲۳۰ نانومتر، باندهای مربوطه مشاهده و عکس برداری می شود.
جهت اطلاع و سهولت شما کاربر گرامی برای استفاده از خدمات مطالعات حیوانی – بافت شناسی – آزمایشگاه بیوتکنولوژی – آزمایشگاه پاتولوژی – آزمایشگاه ژنتیک – اسانس گیری – جنین شناسی – میکروبیولوژی توسط لینک های مربوطه اقدام نمایید.
مطالب مرتبط: بیوفیلم میکروبی – روش تعیین حداقل غلظت ممانعت کنندگی (M.I.C) – روش تعیین حداقل غلظت کشندگی (M.B.C) – تست دیسک دیفیوژن
خدمات مرتبط: خدمات میکروبیولوژی – خدمات پژوهشی در حوزه علم بیوتکنولوژی – تولید پروتئین های نوترکیب
