بافت شناسیمطالعات حيواني

مراحل پرفیوژن و فیکس کردن بافت در بدن حیوانات آزمایشگاهی

فرآیند وارد کردن یک مایع به درون بافت یا تزریق مایع به بافت های زنده را پرفیوژن می گویند. در این فرآیند مایع از طریق جریان سرخرگی به مویرگ های بافتی تحویل داده می شود. یکی از کاربردهای پرفیوژن تثبیت کردن بافت در بدن انسان و یا حیوانات آزمایشگاهی نظیر موش، رت و خرگوش می باشد. هدف از تثبیت کردن، حفظ سریع و یکنواخت ساختار بافت در وضعیتی شبیه به داخل بدن موجود زنده است.

قرار دادن مستقیم قطعات کوچک بافت درون تثبیت کننده ها نظیر فرمالین و پارافرمالدهید، به خوبی منجر به فیکس بافت می شود. در صورتی که غوطه ور کردن نمونه های بزرگتر، به علت ناهمزمانی در انتقال محلول فیکساتیو به بافت، با مشکل مواجه خواهد شد. علاوه بر فیکس نمونه بافتی می توان سلول های بافت کبدی را از این طریق به طور مستقیم جدا نمود.

مزیت استفاده مستقیم از تثبیت کننده از طریق سیستم گردش خون این است که، این ماده شیمیایی با استفاده از شبکه عروقی طبیعی می تواند به سرعت به هر قسمتی از ارگان مورد نظر برسد. به منظور استفاده موثرتر از سیستم گردش خون و روند مناسب فیکس بافت، شدت جریان ورودی فیکساتیو باید با فشارهای فیزیولوژیکی مطابقت داشته باشد. توجه به این نکته ضروری است که فشارهای فیزیولوژیکی به گونه حیوان آزمایشگاهی بستگی دارد. فیکس نمونه های بافتی برای مطالعات بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی لازم می باشد. با استفاده از پرفیوژن قلبی که یک روش کم هزینه، سریع و قابل کنترل است می توان ارگان های مختلف موش و رت را با پارافرمالدئید ۴%، از طریق سیستم عروقی قلب تثبیت نمود. برای انجام این کار لازم است پس از آماده سازی محلول های فیکساتیو و بیهوش کردن موش یا رت، مراحل زیر را به ترتیب انجام داد.

پرفیوژن و فیکس کردن بافت در بدن حیوانات آزمایشگاهی

مراحل فیکساتیو یا تثبیت بافت در بدن حیوانات آزمایشگاهی با استفاده از سیستم پرفیوژن

  1. با استفاده از حمام آب گرم، بافر پرفیوژن را تا ۳۷ درجه سانتیگراد گرم کنید. شیر خروجی دستگاه پرفیوژن را درون لیوان بافر گرم شده قرار دهید. یک سرنگ ۵۰ میلی لیتری را از بافر پر کرده و به لوله تثبیت کننده دستگاه وصل کنید. لوله ها را بطور مکرر با بیرون راندن بافر شستشو دهید.
  2. لوله را با بافر پاک کنید تا تمام حباب های هوا از بین برود. عدم وجود حباب درون لوله ها از اهمیت زیادی برخوردار است.
  3. سرنگ را جدا کرده و ظرف پارافرمالدئید ۴% را به دستگاه متصل کنید. برای جلوگیری از ایجاد حباب هوا در انتهای لوله، در حالی که آن را درون ظرف قرار می دهید لوله را فشار دهید تا قطره بافر از انتهای آن بیرون زده و با سطح سیال داخل ظرف تماس پیدا کند.
  4. ابزارهای جراحی مورد نیاز برای موش های آزمایشگاهی را به منظور سهولت دسترسی تنظیم کنید.
  5. هنگامی که حیوانات آزمایشگاهی به سطح بیهوشی جراحی رسید، آن را روی سینی کم عمق پر از یخ خرد شده قرار دهید. (برای تعیین عمق بیهوشی از عدم رفلکس کف پایی یا رفلکس چشمی در موش و رت استفاده کنید. قبل از ادامه کار، از به هوش نبودن حیوان اطمینان حاصل کنید.)
  6. یک برش جانبی ۵-۶ سانتی متری از طریق قسمت داخلی و دیواره شکم، درست زیر قفسه سینه ایجاد کنید. کبد را با دقت از دیافراگم جدا کنید.
  7. با استفاده از قیچی خمیده یک برش کوچک در دیافراگم ایجاد کنید. موقعیت و فشار انگشت شما می تواند به برش دیافراگم کمک کند.
  8. برش دیافراگم را در تمام طول قفسه سینه ادامه دهید تا پرده جنب نمایان شود.
  9. قیچی های خمیده و بلندی را در امتداد یک طرف دنده ها قرار دهید و ریه ها را با دقت جابجا کنید و از طریق قفسه سینه تا استخوان ترقوه برشی ایجاد کنید.
  10. با بلند کردن جناغ، هر بافتی را که به قلب متصل می شود، با دقت برش دهید. نوک جناغ را با هموستات محکم کنید.
  11. با استفاده از قیچی عنبیه، یک برش کوچک در انتهای خلفی بطن چپ ایجاد کنید.
  12. یک سوزن پرفیوژن ۱۵ را از بطن بریده شده وارد آئورت صعودی کنید. نوک سوزن باید از طریق دیواره آئورت قابل مشاهده باشد و نباید به قوس آئورت برسد.
  13. با یک هموستات برای بستن قلب، این سوزن را محکم کرده و از نشت جلوگیری می کند.
  14. در نهایت، با استفاده از قیچی عنبیه، برشی در دهلیز راست حیوان ایجاد کنید تا خروجی تا حد ممکن بدون آسیب رساندن به آئورت نزولی ایجاد شود. در این مرحله حیوان آماده پرفیوژن است.
  15. خروجی دستگاه را باز کرده و به سوزن متصل کنید و مراقب باشید هیچ حباب هوایی وارد نشود.
  16. ماده تثبیت کننده (پارافرمالدئید ۴%) را با فشار ۸۰ میلی متر جیوه، سریع و یکنواخت پمپ کنید. این فشار را در طول دوره تزریق حفظ کنید.
  17. زاویه سوزن را تنظیم کنید (زاویه سوزن برای دستیابی به حداکثر سرعت جریان بسیار مهم است)
    نکته: فشار می تواند به تدریج تا حداکثر ۱۳۰ میلی متر جیوه  افزایش یابد تا جریان ثابت را حفظ کند.
  18. پس از اتمام کار دستگاه تثبیت کننده، شیر خروجی آن را ببندید.
  19. موش یا موش صحرایی (رت) باید در این مرحله سفت شده باشد.
  20. پارافورمالدئید استفاده شده باید طبق مقررات موسسه شما جمع آوری و ذخیره شود.

جداسازی سلول های کبدی موش آژمایشگاهی با استفاده از سیستم پرفیوژن مدار بسته

پرفیوژن کبدی باید از طریق ورید پرتال گردش شود تا بتواند گردش فیزیولوژیکی ایجاد کند. برای این کار لازم است ابتدا ورید پورتال موجود در کبد حیوانات آمایشگاهی را از طریق ایجاد جریان بسته به ظرف حاوی محیط کشت سلول انتقال داد.

ورید پورتال (PV) رگ اصلی سیستم وریدی پورتال (PVS) است که خون را از دستگاه گوارش، کیسه صفرا، لوزالمعده و طحال به کبد تخلیه می کند. پس از سوراخ کردن ورید پورتال بافر فسفات سالین (PBS) گرم شده در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد از طریق پمپ به جریان در می آید. پس از تایید لوله گذاری موفق با مشاهده تورم و تغییر رنگ کبد، قفسه سینه باز شده و دهلیز راست قلب نمایان می شود. سیستم به مدت ۵ دقیقه با PBS پرفیوژن می شود تا خون خارج شده و از لخته شدن عروق کبدی جلوگیری شود. ورودی متصل به ورید پورتال وارد محیط آزمایش (حاوی DMEM یا RPMI 1640 با ۱۰% FBS و ۱% پنی سیلین-استرپتومایسین) می شود. ورودی دیگر متصل به پمپ، به ورید CAVA متصل می گردد تا مدار را ببندد. پس از ایجاد مدار بسته، گردش می تواند تا ۲ ساعت با محیط حاوی شرایط مختلف آزمایشی حفظ شود. انتخاب محیط گردش و اجزای آن بستگی به هدف آزمایش دارد. حجم مطلوب محیط پرفیوژن باید بر اساس سیستم پرفیوژن هر آزمایشگاه تعیین شود. گردش بیش از ۲ ساعت توصیه نمی شود، زیرا زنده ماندن و عملکرد سلول ها پس از ۲ ساعت ( احتمالا به دلیل افزایش استرس هیپوکسیک ) به طور قابل توجهی کاهش می یابد.

مطالب مرتبط: رنگ آمیزی های بافت شناسیآماده سازی لام از بافت هاتکنیک ایمونوهیستوشیمی
خدمات مرتبط:
 بافت‌ شناسی، مهندسی بافت و رنگ آمیزی های پاتولوژی – پژوهش و مطالعه بروی حیوانات آزمایشگاهی

نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

1 × 5 =

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا