اجزا تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمیدها ی بیانی Multiple Cloning Site & Blue-White Screening

اجزا تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمیدها ی بیانی Multiple Cloning Site & Blue-White Screening

Multiple Cloning Site

کلونینگ DNA داخل یک وکتور شامل اتصال قطعه‌ای از DNA هدف به DNA وکتور می‌باشد. برای وارد کردن قطعه DNA درون پلاسمید از آنزیم های محدودکننده استفاده می شود. این آنزیم ها مولکول DNA را در توالی نوکلوتیدی خاصی قطع می‌کنند. به این توالی نوکلئوتیدی، جایگاه محدودکننده می گویند. گروهی از آنزیم های محدودکننده می توانند، انتهای چسبنده در انتهای قطعه DNA ایجاد کنند. این ویژگی آنزیم ها برای کلون کردن ژن درون پلاسمید استفاده می شود.

برای این کار قطعه DNA یی که قرار است وارد پلاسمید شود را طوری طراحی می کنند که در دو طرف توالی ژنی، جایگاه برش آنزیم قرار داشته باشد. همچنین پلاسمید را با همان آنزیم ها برش می دهند تا انتهای چسبنده مکمل قطعه DNA ایجاد شود. البته کاربرد انتهای چسبنده به تنهایی برای تولید DNA نوترکیب کفایت نمی‌کند چرا که پیوند بین نواحی تک رشته‌ای از نوع پیوند هیدروژنی  بین بازهای نیتروژنی DNA است و به اندازه‌ی کافی قوی نیست تا دو مولکول DNA را به همدیگر متصل نگاه دارد. برای رفع این مشکل باید پیوند کوالان فسفودی‌استر بین قطعات برقرار کرد که این عمل با به کاربردن آنزیم دیگری به نام آنزیم لیگاز مقدور می‌گردد.

برای آسان‌تر شدن کلونینگ، اغلب وکتورها دارای یک جایگاه به اسم جایگاه کلونینگ چندگانه یا (Multiple Cloning Site (MSC که جایگاه شناسایی چندین آنزیم محدود کننده می باشد. بنابراین می‌توان با انتخاب آنزیم محدودکننده مناسب کلونینگ را انجام داد.
MCSهای بسیاری از پلاسمیدها با توالی کد کننده lacZ همپوشانی دارند. در صورت کلون شدن ژن هدف در جایگاه کلونینگ اینگونه پلاسمیدها، ژن lacZ غیر فعال شده و با استفاده از غربالگری سفید-آبی می‌توان سلول های حاوی پلاسمید نوترکیب را تمیز داد.

Blue-White Screening

برای انتخاب کلونی هایی که پلاسمید حاوی توالی ژن نوترکیب هستند، روش غربالگری Blue-White Screening  بکار برده می شود. در این روش از اپران lacZ  که آنزیم بتاگالاکتوزیداز را بیان می کند، استفاده می شود. در صورت حضور ماده X-gal  در محیط، آنزیم بتاگالاکتوزیداز آن را به گالاکتوز و یک رنگدانه آبی نامحلول تجزیه می کند و در نتیجه کلونی های آبی رنگ تولید می شود. از این ویژگی اپران lacZ برای غربالگری کلونی هایی که پلاسمید نوترکیب را دریافت کرده اند، استفاده می کنند. در این روش جایگاه برش آنزیم محدودکننده درون اپران lacZ قرار دارد. درصورتیکه کلونینگ به درستی انجام گیرد، توالی ژنی مورد نظر درون این اپران قرار می گیرد و اپران غیرفعال می شود. درنتیجه آنزیم بتاگالاکتوزیداز تولید نمی شود و کلونی های حاصل از این سلول های حاوی پلاسمید نوترکیب، سفید خواهد بود.

کلونی های سفید پلاسمید نوترکیب را دریافت کرده اند و کلونی های آبی رنگ پلاسمیدهای فاقد ژن مورد نظر می باشند.

مطالب مرتبط: Promoter & Replicon Region اجزا و نواحی تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمیدهای بیانی – نواحی تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمید Selection Marker Ribosome Binding Site