آماده سازی بافت در آزمایشگاه بافت شناسی
فیکس کردن، پروسس بافتی و قالب گیری پارافینی جهت آماده سازی بافت
آماده سازی بافت، پایه انواع تکنیک های بافت شناسی نظیر ایمونوهیستوشیمی، تست تانل، ایمونوفلورسانس و انواع رنگ آمیزی عمومی و اختصاصی نظیر هماتوکسیلین–ائوزین و تری کروم ماسون است. از مهمترین عوامل برای آماده سازی بافت پیش از انجام تمام روش های رنگ آمیزی در آزمایشگاه بافت شناسی، می توان به مراحل فیکس کردن، پروسس بافتی و قالب گیری اشاره کرد.
فیکس کردن بافت (Fixation)
در فیکس کردن از مواد شیمیایی برای حفظ و نگهداری ساختار بافت به شکل طبیعی خود برای زمان طولانی استفاده می شود تا از تخریب آن توسط اتصالات برگشت ناپذیر پروتئین ها جلوگیری شود. برای اطمینان از حفظ ساختار بافتی و مورفولوژی سلولی، فیکس کردن سریع و صحیح ضروری است. فیکس کردن نامناسب یا طولانی مدت ممکن است به طور قابل توجهی قابلیت اتصال آنتی بادی ها را در تکنیک ایمونوهیستوشیمی کاهش دهد.
فیکس کردن بافت ها را می توان با روش های شیمیایی یا فیزیکی انجام داد. روش‌های فیزیکی شامل گرمایش، امواج مایکروویو و انجماد (خشک کردن انجمادی) است. تثبیت حرارتی به ندرت در نمونه‌های بافتی استفاده می‌شود و کاربرد آن صرفا به تهیه اسمیر میکروارگانیسم‌ها محدود می‌شود. تثبیت بافت به وسیله سرما، معمولاً به شکل خشک کردن انجمادی کاربردهایی در هیستوشیمی دارد، اما معمولاً برای نمونه های تشخیصی اعمال نمی شود.
فیکس کردن شیمیایی را معمولاً با فرو بردن نمونه در فیکساتور های معمول انجام می دهند. البته در مورد برخی حیوانات آزمایشگاهی نظیر موش و رت، برخی از اندام‌ها را به طور کامل در فیکساتور فرو می برند. روش دیگر پرفیوژن کردن بافت توسط همین فیکساتور به واسطه سیستم عروقی جاندار می باشد.
فیکساتیو های مورد استفاده روتین شامل الکل‌ها، اسید پیکریک- فرمالدئید، پارافرمالدئید، فرمالین و بوئن می شود. فرمالین یک بافر خنثی و انتخابی رایج برای مرحله فیکس کردن است.
مطلب پیشنهادی: تکنیک ایمونوسیتوشیمی – تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC – تکنیک وسترن بلات – مراحل پرفیوژن و فیکس کردن بافت در بدن حیوانات آزمایشگاهی
فرمالین فیکساتوری رایج در بافت شناسی است. مزیت آن این است که بسیاری از آنتی ژن ها را می توان با آنتی بادی اختصاصی شان در مقاطع بافتی پارافینی فیکس شده، شناسایی کرد. بوئن فیکساتور دیگری است که به دلیل حفظ عالی هسته ها و گلیکوژن برای بررسی جنین و بافت مغز استفاده می شود و به دلیل رنگ دار بودن این محلول می توان برای نمونه های بسیار ریز ( به جهت پدیدار بودن نمونه بافتی ) نیز از آن استفاده کرد. اما نقطه ضعف آن این است که بافت های کلیه را به خوبی حفظ نمی کند و همچنین ساختار میتوکندری ها را به هم می ریزد.
برای اطلاع از انواع آنتی بادی های موجود و دریافت مشاوره رایگان در مورد مسیر های سیگنالینگ انواع آنتی بادی ها اینجا کلیک کنید
برای دریافت بهترین نتایج، در مورد بافت های مهره داران (به ویژه بافت های عصبی) معمولاً برای حفظ ساختار بافت نیاز به فیکس کردن بافت ها درون بدن حیوان آزمایشگاهی به وسیله ی پرفیوژن است.
محلول های فیکساتیو ممکن است حاوی یک یا چند عامل فیکساتیو یا بافر برای تثبیت pH باشد.
رایج ترین فیکساتورهای مورد استفاده برای ایمونوهیستوشیمی
- پارافورمالدئید ۴% در بافر ۰.۱ فسفات ۰.۱ مولار
- پارافورمالدئید ۲% با ۰.۲% اسید پیکریک در بافر فسفات ۰.۱ مولار
- تثبیت کننده PLP: پارافرمالدئید ۴% ، ۰.۲% پریودات و ۱.۲% لیزین در بافر فسفات ۰.۱ مولار
- پارافورمالدئید ۴% با ۰.۰۵% گلوتارآلدئید (جهت انجام ایمونوهیستوشیمی و مشاهده با میکروگرافی TEM)
فیکس کردن به روش فروزن
در مورد برخی رنگ آمیزی ها مثل رنگ آمیزی اویل رد (Oil Red O Stain) که به دلیل بررسی چربی در این نوع رنگ آمیزی نمی توان از گزیلل و دیگر محلول های پروسس بافتی استفاده کرد و یا در تکنیک ایمونوهیستوشیمی برخی از آنتی ژن ها در مقادیر متوسط فیکساتیو های آلدئیدی از بین می روند. در این شرایط، بافت ها باید به سرعت در نیتروژن مایع منجمد و بدون نفوذ ساکارز با کرایواستات برش فروزن داده شوند. برش ها باید تا زمانی که با استون سرد یا الکل تثبیت شوند، در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد یا پایین تر منجمد شوند. پس از تثبیت، می توان برش ها را با استفاده از پروتکل های استاندارد رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی پردازش کرد.
پروسس بافتی
پروسس بافتی روشی برای حذف آب از سلول‌ها و جایگزینی آن با ماده ای است که اجازه می‌دهد مقاطع نازکی (در حد میکرون) به وسیله میکروتوم بریده شود. زمانی که بافت به درستی فیکس شد، فرآیند آب گیری و شفاف سازی را طی می کند.
مرحله آب گیری در پروسس بافتی
از آنجایی که پارافین آبگریز است، آب داخل نمونه باید قبل از نفوذ به پارافین خارج شود. این فرآیند با غوطه ور کردن نمونه ها در الکل انجام می شود. الکل به تدریج جایگزین آب در تمام سلول های نمونه می شود. افزایش غلظت الکل (معمولاً از ۷۰٪ تا ۱۰۰٪) برای جلوگیری از به هم ریختن ساختار بافت استفاده می شود.
مرحله شفاف سازی در پروسس بافتی
با توجه به اینکه الکل ها و پارافین ها قابل اختلاط نیستند، باید از یک حلال میانی که کاملاً با هر دو قابل اختلاط باشد (مانند زایلن یا اصطلاحا گزیلول) استفاده شود. این حلال الکل را در بافت از طریق فرآیندی به نام شفاف سازی جابجا می کند. نقش مهم عامل شفاف کننده، حذف مقدار قابل توجهی چربی از بافت است که در غیر این صورت مانعی برای نفوذ پارافین ایجاد می کند.
مطلب پیشنهادی: آماده سازی لام از بافت ها – رنگ آمیزی های بافت شناسی
تهیه مقاطع بافتی
موم پارافین به عنوان پرکاربردترین ماده برای قالب گیری های بافت شناسی در آزمایشگاه‌های بافت شناسی استفاده می شود. پارافین در دمای تقریبی ۶۰ درجه سانتیگراد گرم و به مایع تبدیل می شود و می تواند به بافت ها نفوذ کند. پس از نفوذ پارافین مذاب به بافت‌ها، زمانی که پارافین سرد و جامد شد، امکان برش دادن قالب تهیه شده با میکروتوم فراهم می‌شود. با انتخاب فرمولاسیون های مختلف پارافین می توان میزان حمایت ساختاری ارائه شده توسط پارافین را تنظیم کرد.
مقاطع پارافینی نتایج رضایت بخشی را در شناسایی اکثر آنتی ژن های بافتی با استفاده از تکنیک های بازیابی آنتی ژن ایجاد می کند.
با توجه به اینکه برخی از آنتی ژن های سلولی با استفاده از فیکساتیو های معمول و قالب گیری پارافینی از بین می روند. استفاده از مقاطع منجمد برای شناسایی بسیاری از آنتی ژن ها ضروری است. با این حال، معایب استفاده از مقاطع منجمد شامل مورفولوژی ضعیف، وضوح پایین در بزرگنمایی‌های بالا، نیاز به تجهیزات ذخیره‌سازی ویژه و دشواری تهیه برش نسبت به مقاطع پارافینی می شود.
مطالب مرتبط: تکنیک ایمونوهیستوشیمی IHC – آماده سازی لام از بافت ها – تکنیک ایمونوسیتوشیمی
خدمات مرتبط: بافت شناسی، مهندسی بافت و رنگ آمیزی های پاتولوژی – پژوهش و مطالعه بروی حیوانات آزمایشگاهی
