اندازه گیری آنتی اکسیدان و رادیکال های آزاد به وسیله ی تکنیک الایزا

بدن انسان مجهز به یک سیستم آنتی اکسیدانی قوی است که برای مقابله با اثرات مضر رادیکال های آزاد اکسیداتیو عمل می کند. هنگامی که تعادل بین آنتی اکسیدان ها و گونه های ROS، که به آن هموستاز ردوکس گفته می شود، مختل شود، استرس اکسیداتیو رخ می دهد. اختلال در این تعادل پرو اکسیدانی و آنتی اکسیدانی می تواند در نتیجه افزایش تولید رادیکال های آزاد، غیرفعال شدن آنزیم آنتی اکسیدانی یا مصرف بیش از حد آنتی اکسیدان باشد. بنابراین ارزیابی وضعیت آنتی اکسیدانی می تواند گزارشگر مناسبی از وضعیت بدن در برابر عوامل ناسالم باشد.

هموستاز ردوکس توسط دو دسته از سیستم آنتی اکسیدانی تنظیم می شود: ترکیبات آنزیمی و غیر آنزیمی. ترکیبات آنزیمی مانند: سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پروکسیداز، گلوتاتیون S ترانسفراز و ترکیبات غیر آنزیمی مانند: گلوتاتیون، ویتامین A ،C ،E.

برای اطلاع از انواع کیت های آنتی اکسیدانی، استرس اکسیداتیو و دریافت مشاوره رایگان در مورد انتخاب بهترین روش اینجا کلیک کنید

ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی

برای ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی ترکیبات ناشناخته از اندام هایی مانند کلیه و کبد حیوانات آزمایشگاهی مطابق با اصول اخلاقی استفاده می شود. پس از جداسازی بافت از حیوانات آزمایشگاهی بیهوش، هموژن های بافتی در محلول نرمال سالین ۱۰ درصد تهیه و در ۲۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ می شوند. مایع رویی برای فعالیت های آنزیمی و غیر آنزیمی MDA-SOD-GPX-CAT-GSH-GSTs و … استفاده می شود.

 سوپراکسید دیسموتاز (SOD)

خانواده ای از آنزیم های آنتی اکسیدانی است که سطوح ROS را با کاتالیز کردن فرآیند، تبدیل سوپراکسید به پراکسید هیدروژن و اکسیژن مولکولی تنظیم می کند. این ترکیب یک عامل اصلی در دفاع در برابر رادیکال های آزاد اکسیژن است. با غیرفعال کردن اسید نیتریک و مهار تشکیل پراکسی نیتریت از اختلال عملکرد اندوتلیال و میتوکندری جلوگیری می کند. همچنین می تواند رادیکال های اکسیژن تولید شده در زنجیره تنفسی را پاک کند. در اندازه گیری SOD، سیستم گزانتین-گزانتین اکسیداز رادیکال های سوپراکسید تولید می کند و با رادیکال یدونیتروتترازولیوم (INT) واکنش می دهد تا فرمازان رنگی را تشکیل دهد. شدت رنگ حاصل از این واکنش در یک دوره ۳ دقیقه ای در طول موج ۵۰۵ نانومتر قابل اندازه گیری است.

مطلب پیشنهادی: تکنیک الایزا – انواع آنتی اکسیدان ها و رادیکال های آزاد

گلوتاتیون پروکسیداز (GPX)

کاتالیز آنزیمی گونه های فعال اکسیژن را انجام می دهد. GPX-1 از تجمع پراکسید هیدروژن در سلول جلوگیری می کند. این ماده مسئول پاکسازی رادیکال های اکسیژن فعال از طریق گلوتاتیون همراه با گلوتاتیون ردوکتاز است. روش اندازه گیری GPX اکثرا بر اساس گزارش اسپکتروفتومتری کاهش NADPH است. اندازه گیری آن در طول موج ۳۴۰ نانومتر انجام می شود.

کاتالاز (CAT)

کاتالاز آنزیمی است که در تمام سلول ‌های بدن یافت می‌شود. این آنزیم پراکسید هیدروژن را به آب و اکسیژن تبدیل می‌کند. فعالیت کاتالاز تا حد زیادی در اندامک های درون سلولی معروف به پروکسیزوم قرار دارد. تحویل هدفمند کاتالاز به کبد توسط آلاکتوزیلاسیون، متاستاز کبدی را سرکوب می‌کند و فعالیت متالوپروتئیناز ماتریکس (MMP) را کاهش می‌دهد، در حالی که کاهش کاتالاز با ظهور فنوتیپ بدخیم در کراتینوسیت‌ها همراه است. کاتالاز همچنین بیان پایه و وابسته به MnSOD MMPs و رسوب کلاژن را کاهش می دهد. فعالیت کاتالاز با استفاده از روش اسپکتروفتومتری از طریق  حذف پراکسیدها  اندازه گیری می‌شود.

مالون دی آلدهید (MDA)

یکی از مهمترین محصولات پراکسیداسیون لیپیدی است که می تواند بر تبادل یونی در غشای سلولی تأثیر بگذارد و همچنین منجر به اثرات نامطلوبی مانند تغییر در نفوذپذیری یون ها و فعالیت آنزیمی شود. MDA به علت واکنش پذیری با بازهای نیتروژن، جهش زا، ژنوتوکسیک و سرطان زا می باشد. اندازه گیری مالون دی آلدئید بر اساس رنگ تشکیل شده با اسید تیوباربیتوریک است.

MDA در نتیجه انکوباسیون با تیوباربیتوریک اسید در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد و pH 3.4 در شرایط هوازی یک کمپلکس صورتی تشکیل می دهد. سطح این کمپلکس بر حسب نانومول بر میلی لیتر مالون دی آلدئید (MDA) بیان می شود که با اندازه گیری اسپکتروفتومتری در طول موج ۵۳۲ نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر تعیین می گردد.

گلوتاتیون اس ترانسفراز ها (GSTs)

Glutathione S-Transferase اعضایی از خانواده چند ژنی ایزو آنزیم ها هستند که در همه سلول های بدن انسان بیان می شوند. تعدادی از ایزوآنزیم های GST علاوه بر نقش کاتالیزوری خود در ترکیب GSH با انواع ترکیبات الکتروفیل مضر برای سم زدایی، هیدروپراکسیدهای لیپیدی را از طریق فعالیت GPX مستقل از سلنیوم کاهش می دهند و محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدی مانند ۴-HNE را سم زدایی می کنند. فعالیت آنها را معمولاً با روش Habig تعیین می کنند که اساس این تکنیک بر مبنای توانایی GST برای ترکیب ۱-کلرو-۲،۴-دینیتروبنزن (CDNB) به گلوتاتیون کاهش یافته است. این کونژوگه با افزایش جذب در طول موج ۳۴۰ نانومتر همراه است که می تواند به واسطه ی اسپکتروفتومتری اندازه گیری شود و از این طریق به طور مستقیم سطح فعالیت GST در نمونه های بالینی تخمین زده می شود.

گلوتاتیون با وزن مولکولی کم (GSH)

GSH، که در سلول به عنوان یک تری پپتید (اسید گلوتامیک) سنتز می شود، به دو شکل مختلف وجود دارد: یک اکسید و یک احیا کننده. در تمام سلول ها به جز گلبول های قرمز مشاهده می شود و برای مکانیسم های هموستاتیک مهم است. این ماده در فرآیندهای مختلفی از جمله دفاع آنتی اکسیدانی، سم زدایی از بیگانه بیوتیک های الکتروفیل، تنظیم پاسخ های تنظیم شده از طریق انتقال سیگنال، سنتز دئوکسی ریبونوکلئوتید، تنظیم پاسخ های ایمنی، و متابولیسم لوکوترین و پروستاگلاندین نقش دارد. علاوه بر عملکردهای بیوشیمیایی، GSH در پاکسازی ROS نیز نقش دارد. در سنجش این ترکیب از روش غیر آنزیمی و یا واکنش شیمیایی استفاده می شود. برای این کار لازم است ترکیب نمونه خونی و یا لیزات بافت رقیق شده را با متافسفریک اسید، دی سدیم EDTA و کلرید سدیم مخلوط کرده و پس از انکوباسیون به مدت ۵ دقیقه و فیلتر نهایی ترکیب، خوانش نمونه با استفاده از دستگاه الایزا ریدر انجام خواهد شد.

برای اطلاع از انواع کیت های آنتی اکسیدانی، استرس اکسیداتیو و دریافت مشاوره رایگان در مورد انتخاب بهترین روش اینجا کلیک کنید

مطالب مرتبط: آنتی بادی ها در تست های آزمایشگاهی – تکنیک الایزا – تکنیک وسترن بلات
خدمات مرتبط: انجام تکنیک الایزا و وسترن بلات با بانکی غنی از انواع آنتی بادی – انجام خدمات ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی با بانکی غنی از انواع آنتی بادی