Real-time PCR همانند سایر روش های آزمایشگاهی نیازمند رعایت استانداردهای خاصی می باشد تا نتایج موردنظر حاصل گردد. از آنجا که مواد و ترکیبات متعددی شامل آنزیم، پرایمر، dNTPs، MgCl۲ و DNA الگو در واکنش PCR دخیل هستند، مقدار و غلظت به کار رفته هر یک از این مواد در واکنش نهایی PCR می تواند در نتیجه نهایی کار تاثیرگذار باشد.
برنامه دمایی به کار رفته برای هر ران PCR در صورتیکه به درستی و متناسب با پرایمر های ژن مورد نظر و اندازه محصول PCR نهایی تنظیم نگردد نتیجه حاصل از PCR مطلوب نخواهد بود. خوشبختانه امروزه شرکت های تولید کننده کیت های PCR، تمامی اجزای مورد نیاز را به نسبتی استاندارد طراحی و عرضه می کنند به طوریکه نیازی به محاسبه دقیق مقدار تک تک اجزای PCR توسط محققان وجود ندارد.
مشکلات متداول در real-time PCR ، علل احتمالی و راه حل های موجود
عدم مشاهده نمودار تکثیر مناسب برای محصول PCR مورد نظر
علت: ممکن است مقدار DNA یا cDNA مورد استفاده بسیار کم بوده یا استخراج RNA یا DNA به درستی صورت نگرفته باشد. همچنین ممکن است PCR به دلیل وجود مهارکننده انجام نشده باشد یا اینکه دمای اتصال در نظر گرفته شده برای پرایمرهای مورد نظر مناسب نباشد.
راه حل ها
- استخراج DNA یا RNA با استفاده از کیت و یا طبق پروتکل های استاندارد انجام گردد.
- تست های تاییدی جهت حضور DNA یا RNA در نمونه استخراج شده شامل ژل الکتروفورز و قرائت جذب نمونه ها با نانودراپ صورت گیرد.
- در مراحل استخراج RNA و DNA با مصرف به اندازه محلول ترایزول یا بافر لیزکننده از آلودگی فنولی جلوگیری گردد. همچنین پیش از حل نمودن رسوب در آب، از تبخیر الکل مورد استفاده جهت شستشوی رسوب اطمینان حاصل گردد.
- دمای بهینه برای اتصال پرایمرها ابتدا با استفاده از گرادیانت PCR تعیین و سپس در دمای مناسب Real time pcr گذاشته شود.
مشاهده چندین منحنی ذوب به جای یک منحنی ذوب اختصاصی
علت حضور منحنی ذوب در محدوده ۷۵ درجه بیانگر وجود پرایمر دایمر می باشد. اگر در دماهای بالاتر چندین منحنی ذوب مشاهده گردد احتمالا پرایمرها به صورت غیر اختصاصی به نواحی دیگری از رشته الگو متصل شده و محصول PCR غیر اختصاصی تکثیر گردیده است.
راه حل ها:
- در درجه اول طراحی پرایمرها باید طوری انجام شود که حتی الامکان پرایمر دایمری تشکیل نشود
- رقیق کردن پرایمرها به حذف منحنی پرایمر دایمر کمک خواهد کرد
- دمای اتصال پرایمرها، زمان اتصال پرایمرها و همچنین زمان تکثیر متناسب با محصول PCR اصلی تنظیم گردد به گونه ای که شرایط دمایی و زمانی برای تکثیر محصولات PCR غیر اختصاصی مساعد نباشد
- رقیق سازی DNA الگو یا cDNA به کار رفته در واکنش PCR
مطالب مرتبط: طراحی پرایمر – واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR
خدمات مرتبط: استخراج RNA و DNA سنتز cDNA ، طراحی پرایمر ، انجام تکنیک PCR و Real time PCR
