آموزش جامع رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا (Von Kossa) در آزمایشگاه بافت شناسی

⭐ آنچه در این مطلب خواهید خواند

مقدمه ای از رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا در بافت شناسی

رنگ آمیزی وان کوزا (Von Kossa) به طور گسترده در بافت شناسی برای تشخیص وجود رسوبات غیرطبیعی کلسیم در بدن استفاده می‌شود، به همین علت با عنوان رنگ کلسیم (Calcium Stain) نیز شناخته شده است. اصل این رنگ‌آمیزی مبتنی بر تبدیل نمک‌های کلسیم به نمک‌های نقره است: یون‌های کلسیم، متصل به فسفات‌ها، با یون‌های نقره که با محلول نیترات نقره آورده می‌شوند، جایگزین می‌شوند. فسفات های نقره که در زیر یک منبع نور قرار می گیرند، دچار تخریب فتوشیمیایی می شوند که منجر به مشاهده رسوبات فلزی نقره می‌شود.

تاریخچه رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا

بیش از یک قرن پیش، پزشک مجارستانی جولیوس وان کوزا (Julius von Kossa) یک روش رنگ‌آمیزی کلاسیک را برای تشخیص رسوبات معدنی در بافت‌های حیوانی ابداع کرد. از آن زمان، این روش به طور گسترده استفاده شده و با ضد رنگ‌های مختلف ترکیب شده است. وان کوزا در یکی از اولین تحقیقات خود، بخش هایی از کلیه را با محلول های ۱ تا ۵ درصد نیترات نقره تیمار کرد که منجر به رنگ زرد رسوبات کلسیم شد. این رنگ موقت بود و به تدریج از رنگ خاکستری به سیاه تغییر کرد. برای نشان دادن یافته‌های خود، او تصویری از کلیه اسب مسموم شده با سولفات مس ارائه داد.

انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا در بافت شناسی

این رنگ برای تشخیص کلسینوز (Calcinosis) مانند کندروکلسینوز (Chondrocalcinosis)، نفروکلسینوز (Nephrocalcinosis)، کلسینوز جلدی (Cutaneous Calcinosis) مفید است. همچنین می‌توان از آن برای تشخیص کلسیفیکاسیون در تومورها استفاده کرد.
سنجش میزان رسوب کلسیم داخل سلولی به روش رنگ‌سنجی در تمایز سلولهای مزانشیمی به استئوبلاست نیز با رنگ آمیزی وان کوزا انجام می‌شود.

نگاهی اجمالی به کلسیم رنگ شده با وان کوزا

کلسیم برای همه موجودات زنده ضروری است، جایی که جداسازی و انتشار Ca2+ در داخل و خارج سیتوپلاسم به عنوان یک سیگنال برای بسیاری از فرآیندهای سلولی عمل می‌کند. ۹۹ درصد کلسیم در استخوان‌ها و دندان‌ها و ۱ درصد باقی‌مانده در خون و بافت نرم یافت می‌شود. سطح کلسیم سرم به شدت کنترل می‌شود (۸.۴-۱۱.۴ میلی گرم در دسی لیتر) و هر گونه تغییر خارج از این محدوده می‌تواند اثرات جدی داشته باشد. کلسیم در انقباض و شل شدن عروق خونی، انتقال پالس‌های عصبی، انقباض عضلانی و ترشح هورمون نقش دارد. کانال‌های یون کلسیم، مهاجرت یون‌های کلسیم را در غشای سلولی کنترل می‌کنند و امکان فعال‌سازی و مهار طیف وسیعی از آنزیم‌ها را فراهم می‌کنند. علل سطوح پایین کلسیم عبارتند از نارسایی مزمن کلیه، کمبود ویتامین D و سطوح پایین منیزیم خون که می‌تواند در اعتیاد شدید به الکل رخ دهد.

انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌آمیزی اختصاصی وان کوزا

رنگ آمیزی وان کوزا را می توان روی انواع بافت هایی که ممکن است دارای رسوب غیرطبیعی کلسیم باشند استفاده کرد. اغلب بافت هایی مانند مفاصل، رگ‌های خونی و کلیه‌ها می‌توانند جز این موارد هستند.

در این مقاله به یکی از پروتکل های ستاپ شده رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا می‌پردازیم.

پروتکل رنگ‌آمیزی اختصاصی وان کوزا در بافت‌شناسی

در این پروتکل برای رنگ آمیزی هسته سلولها و سیتوپلاسم، از رنگ Nuclear red استفاده می شود.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ‌آمیزی اختصاصی وان کوزا

1. پس از جدا نمودن بافت موردنظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت­ها را در فرمالین ده درصد فیکس می­کنیم.
2. در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت­ها قرارداده و نام یا کد نمونه­ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
3. آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه­‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین با غلظت‌­های افزایشی اتانول این مرحله انجام می­شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می­گردد.
4. قالب­گیری بافت: بلوک‌­های پارافینی از نمونه‌­های بافتی با استفاده از دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ و پارافین جامد انجام می­دهیم.
5. برش­گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب­‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش­‌های نازک در حد ۵ الی ۱۰ میکرومتر تهیه می­کنیم.
6. آبدهی نمونه برش­‌زده: برش‌­های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می­کنیم.
7. اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌­آمیزی رنگ می­کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا

1. لام های آماده شده را در محلول ۵% نقره نیترات یا محلول رنگی وان کوزا شناور می کنیم.
2. لام ها را در معرض نور طبیعی یا لامپ UV به مدت ۲۰ دقیقه قرار می‌دهیم و پس از آن لام‌ها را با آب مقطر شستشو می‌دهیم.
3. لام ها را در محلول سدیم تیوسولفات ۲ درصد به مدت ۲ دقیقه انکوبه می کنیم و با جریان آب شستشوی مختصر می‌دهیم.
4. نمونه های بافتی را اکنون با محلول رنگی ۱% Nuclear red به مدت ۲ دقیقه تیمار نموده و سریعا دهیدراته می کنیم.
5. پس از خشک شدن لام‌ها، با چسب انتلان و لامل نمونه‌ها را مونت کرده و با میکروسکوپ فلورسنت بررسی می‌کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی وان کوزا

مواد مورد نیاز

• اتانول مطلق
• پارافین
• آب مقطر
• فرمالین ده درصد
• چسب انتلان
• نقره نیترات
• لامپ UV
• سدیم تیوسولفات
• Nuclear red  

تجهیزات مورد نیاز

• میکروسکوب 
• دستگاه میکروتوم
• دستگاه گرمکن اسلاید بافتی
• دستگاه پارافین دیسپنسر 
• دستگاه تیشو امبدینگ
• لام و لامل

جهت مطالعه بیشتر، تجهیزات عمومی و تخصصی در آزمایشگاه بافت شناسی را کلیک کنید.

تفسیر نتایج رنگ آمیزی وان کوزا

تکنیک رنگ آمیزی وان کوزا یک واکنش دو مرحله‌ای است: اول، کاتیون‌های نقره با اجزای رسوبات کلسیم واکنش می‌دهند که منجر به رنگ زرد ناپایدار می‌شود، در حالی که در مرحله دوم، مواد آلی نقره متصل شده را به نقره فلزی سیاه با کمک نور تغییر می‌دهند. Nuclear red اجازه می دهد تا هسته سلول‌ها به رنگ قرمز و سیتوپلاسم آنها به رنگ صورتی رنگ‌آمیزی شود. یکی از روش های تشخیص انواع کلسینوز در پاتولوژی، رنگ آمیزی وان کوزا است به عنوان مثال در کلسینوز دستگاه گوارش از جمله کلسینوز مخاط مری که یک بیماری نادر است رسوبات کلسیمی به راحتی قابل شناسایی است.

در برخی از پروتکل ها، علاوه بر اینکه رسوبات کلسیمی، به رنگ سیاه مشاهده می شود، کلاژن و استئوید (Osteoid) نیز قرمز رنگ می شوند که سبب تشخیص و بررسی دقیق‌تر نمونه بافتی می شود.

ارائه خدمات رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا در آزمایشگاه بافت شناسی

انواع روش‌های رنگ‌آمیزی از تکنیک های رایج در آزمایشگاه بافت‌شناسی است و برای ایجاد تمایز بین اجزای مختلف بافت‌ها و سلول‌ها جهت آنالیز دقیق نمونه ها استفاده می‌گردد. یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه های بافتی، مایعات بدن و سلولهای مختلف، رنگ آمیزی اختصاصی وان کوزا است.
آزمایشگاه بافت شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، آماده ارائه خدمات رنگ آمیزی وان کوزا برای انواع نمونه های انسانی و حیوانات آزمایشگاهی مطرح شده در طرح های پژوهشی می باشد.

جمع بندی

کلسیفیکاسیون بافت در مشکلات فرآیندهای متابولیکی بدن و در تومورها نیز نقش بسزایی دارد. بنابراین تکنیک‌های معتبر بررسی رسوبات کلسیم به تشخیص دقیق پزشکی و تحقیقاتی پاتولوژی کمک می‌کند. همانطور که توضیح داده شد یکی از این تکنیک ها، رنگ آمیزی وان کوزا در آزمایشگاه پاتولوژی است که به بررسی کلسیم در نمونه بافتی می پردازد.

سوالات متداول

❔ رنگ آمیزی وان کوزا برای چه مواردی در آزمایشگاه پاتولوژی استفاده می شود؟
✔️ رنگ آمیزی وان کوزا به طور گسترده در بافت شناسی برای تشخیص وجود رسوبات غیر طبیعی کلسیم در بدن استفاده می شود.

❔ اساس تکنیک رنگ آمیزی وان کوزا در بافت شناسی چیست؟
✔️ اصل این رنگ‌آمیزی مبنی بر تبدیل نمک‌های کلسیم به نمک‌های نقره است: یون‌های کلسیم، متصل به فسفات‌ها، با یون‌های نقره در محلول نقره نیترات جایگزین می‌شوند و نهایتا رسوبات کلسیمی به رنگ سیا حاصل می شود.