خدمات سلولی مبتنی بر آخرین متد ها و مقالات روز دنیا

ATCC (American Type Culture Collection) به عنوان یک مرکز منابع بیولوژیکی، آزمایشات احراز هویت رده سلولی و کنترل کیفیت را بر روی تمام رده های سلول ها انجام داده است. بنابراین، بدست آوردن اطلاعات از شرایط مختلف یک رده سلولی با استفاده از سایت ATCC راهی مطمئن برای انجام تست های آزمایشگاهی بر روی یک رده سلولی می باشد. به این ترتیب هنگام انتشار تحقیقات انجام شده با رده سلولی، ارائه شماره کاتالوگ ATCC باید در بخش مواد و روشهای تحقیق گنجانده شود. بر همین اساس استفاده از مورفولوژی سلول با استفاده از میکروسکوپ، آنالیز منحنی رشد سلول و بررسی سرعت دو برابر شدن سلول، تشخیص رده سلول با استفاده از الکتروفورز ایزوانزیم ها، تست DNA سلولی یا STR analysis (DNA fingerprinting) می تواند در تشخیص رده سلولی استفاده شود.

روش های مختلفی برای بررسی میزان بقا و زنده مانی سلول ها وجود دارد. تست های مربوط به میزان نفوذپذیری رنگ های حیاتی از طریق غشا سلولی به عنوان ساده ترین راه تشخیص سلول های مرده از زنده می باشد که معمولا با رنگ تریپان بلو انجام می شود. از دیگر رنگ های این تشخیص می توان به رنگ اوانس بلو (Evans blue) اشاره کرد که میزان نفوذپذری رنگ به داخل بافت، نشان دهنده آسیب و مرگ سلول و عدم رنگ پذیری سلول نشان دهنده بقا و زنده مانی سلول می باشد. کلسئین (Calcein AM)، اکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید، از دسته موادی هستند که میزان بقا سلول را با سلامت و تخریب DNA را نشان می دهند که با رنگ پذیری سلول نسبت به این مواد سلول زنده از سلول های مرده قابل تفکیک می شود که این امر با میکروسکوپ فلورسانت قابل بررسی هستند. ترکیباتی که در واکنش با میتوکندری با تشکیل رسوبات فورمازان میزان بقا را نشان می دهند اصولا شامل موادی هستند که با دستگاه اسپکتروفوتومتری در طول موج مشخصی با استفاده از کیت های MTT و XTT قابل بررسی هستند. دسته دیگر مواد که با نشان دادن پتانسیل غشا میتوکندری نشان از بقا و سلامت سلول دارند شامل رنگ های فلورسانتی JC1، RHODAMIN 123 و برخی از کیت های تجاری هستند که با روش فلوسیتومتری بررسی می گردند و در نهایت روش های بررسی میزان ROS و یا بررسی میزان اسیب DNA با تکنیک تانل با روش فلوسیتومتری نیز نشان از بقا یا تخریب سلول های مورد بررسی دارد.

به منظور انتقال سلول از فضای خارج آزمایشگاه به آزمایشگاه کشت سلول، محیط کشت سلول از قبل در انکوباتور قرار داده می شود تا به میزان کافی Co2 داشته باشد. سپس فلاسک حاوی سلول با این محیط کاملا پر می شود و می تواند یک روز در فضای بدون انکوباتور قرار گیرد. در این شرایط فلاسک بدون فیلتر با درب کامل بسته شده و در دمای زیر ۲۲ درجه سانتی گراد در یک محفظه مناسب که ظرف کشت در آن ثابت شده باشد و به دور از آلودگی محیط باشد منتقل می شود. برای انتقال بافت جدا شده تازه (Fresh Tissue)، در صورتی که ابعاد بافت کم تر از ۰.۵ * ۰.۵ سانتی متر باشد، می توان در حدود ۳- ۵ ساعت، در محیط کشت سلول با بافر HPSS یا Hank’s Balanced Salt Solution برای جلوگیری از تغییرات PH، یا با سرم فیزیولوژی انتقال داد. ظرف انتقال لازم است در کنار یخ خشک و با پوشاندن درب کامل ظرف با پارافیلم (برای جلوگیری از الودگی) انجام شود. لازم به ذکر است که برای ابعاد بزرگتر تا زیر ۱ ساعت باید نمونه به ازمایشگاه منتقل گردد.

محیط های کشت سلولی را می توان به دو دسته اصلی محیط های طبیعی و محیط های کشت سنتتیک تقسیم کرد. محیط های کشت طبیعی از ترشحات بدن شامل پلاسما، لنف و سرم و یا عصاره بافتی استخراج شده می باشد. که در سه دسته Biological fluids، Tissue extracts و Clots or coagulants دسته بندی می شود. در این دسته FBS شناخته ترین فرآورده است که به محیط های کشت سنتتیک اضافه می گردد.
دسته دوم، محیط های کشت سنتتیک هستند که با استفاده از ترکیبات ارگانیک و غیر ارگانیک تهیه می شوند. Serum-containing media، Serum-free media، Chemically defined media، Protein-free media و Balanced salt solutions (BSS) در این گروه دسته بندی می شوند. در ترکیب همه این محیط ها حداقل چند مورد از ترکیبات ارگانیک، غیر ارگانیک، اسیدهای آمینه غیرضروری، گلوتامین و ویتامین ها وجود دارد. پرمصرف ترین این محیط های کشت شامل:

• – MEM (Minimum Essential Medium)
  – DMEM (Dulbecco’s – Modified Eagle’s Medium)
  – IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)
  – RPMI-1640 & Ham’s F-10

می باشند که در مقدار یا وجود و عدم وجود یکی از ترکیبات فوق با یکدیگر تفاوت دارند و بر همین اساس کاربردهای مختلفی برای رده های سلولی مختلف دارند.

با توجه به وجود انواع آلودگی های موجود در محیط کشت سلول که شامل باکتری، مخمر و قارچ می باشد، روش های تشخیص مختلفی در نظر گرفته شده است. به این ترتیب برای تشخیص باکتری ازتغییر شکل سلول های کشت داده شده، جدا شدن سلول های چسبنده از کف ظرف، حرکت اجزا ریز میکروسکوپی گرد (باکتری های گرد) و یا میله ای شکل (باکتری های میله ای شکل)، تغییر رنگ محیط به رنگ زرد ( به طور معمول محیط کشت حاوی فنول رد است که به عنوان اندیکاتور تغییر PH به محیط های کشت اضافه می شود و به محیط کشت رنگ صورتی می دهد) و کدر شدن محیط کشت سلول می توان استفاده کرد. اما در آلودگی با قارچ و مخمر، حضور تجمعات یا کلامپ های سلولی در حال جوانه زدن برای مخمر، و حضور کلونی ها و ریسه های قارچی مواج و شناور بر سطح محیط کشت برای موارد الودگی قارچی برای تشخیص ضروری می باشد.

انجماد یک روش آزمایشگاهی شناخته شده برای ذخیره سلول ها و سایر مواد بیولوژیکی در نیتروژن مایع با دمای نزدیک به ۱۹۶- درجه سانتی گراد می باشد. به این منظور قبل از انجام مراحل فریز سلول، لازم است ابتدا میزان بقا سلول ها با رنگ حیاتی تریپان بلو چک شود. از سویی دیگر وجود آلودگی سلول با مایکوپلاسما قبل از فریز سلول باید تعیین گردد. به علاوه یک تا دو روز قبل از فریز باید سلول ها پاساژ داده شده و محیط تازه روی سلول ها ریخته شود تا سلول ها در فاز تکثیر قرار گیرند. معمولا سلول با تراکم ۷۰ تا ۸۰ درصد در ظرف کشت مناسب فریز بوده و تعداد ۵۰۰ هزار تا یک میلیون سلول در هر کرایوتیوب ریخته می شود. محیط فریز سلول به صورت معمول حاوی محیط کشت، یک ماده ضد یخ مثل DMSO یا گلیسرول و یک منبع پروتئین مثل سرم FBS می باشد. یک میلی لیتر از مواد فریز با یک میلیون سلول ترکیب شده و با تکنیک فریز آهسته با سرعت فریز ۱°C/minute تا ۸۰- درجه به مدت یک شب قرار می گیرد. سپس در بخار نیتروژن مایع و در نهایت در نیتروژن مایع قرار داده می شود. به منظور دفریز سلول، کرایو ویال از تانک ازت خارج و در دمای ۳۷ درجه قرار می گیرد تا محتویات ذوب شود. سپس بلافاصله به این محتویات تا سه برابر حجم آن محیط کشت از قبل گرم شده اضافه و پس از سانتریفیوژ با سرعت ۱۵۰۰ دور در دقیقه، دمای محیط، به مدت ۵ دقیقه، محیط قبلی خارج و محیط تازه به سلول اضافه و سلول کشت داده می شود.